分离循环肿瘤细胞的方法技术

提供用于测定或分离受试者的循环肿瘤细胞(CTC)的方法。所述方法可包括检测至少一种上皮间充质转化(EMT)生物标志物的表达。还提供用于测定或分离CTC的试剂盒。该试剂盒可包括至少一种EMT生物标志物的抗体。还提供预测受试者对癌症药物的响应性的方法、受试者中癌症药物靶向递送的方法，提供受试者的癌症预后的方法和用于跟踪受试者的癌症进展的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分离循环肿瘤细胞的方法相关申请的交叉引用本申请要求2013年2月2日提交的美国临时申请号61/760,042和2013年3月28日提交的美国临时申请号61/806,358的优先权，其通过引用以其整体结合到本文中。有关联邦政府资助研究的声明在美国国防部授予的联邦资助号W81XWH-10-1-0483和NIH授予的联邦资助号5R01-CA127727-03的政府支持下完成本专利技术。美国政府对本专利技术享有一定权利。序列表序列表仅以电子格式随本申请一起提交，并通过引用结合到本文中。序列表文本文件“WO00_ASFILED_SequenceListing-Text”创建于2013年5月31日，大小为131,252字节。专利
本公开内容涉及用于癌症检测和预后的方法。而且，本公开内容提供用于俘获和分离循环肿瘤细胞(CTC)的方法，所述方法包括可用于与受试者的癌症的预后、诊断或治疗有关的方法的CTC的鉴定、检测和任选计数。专利技术背景可根据形态学、行为和分子特征，将大多数后生动物细胞分为上皮的或间充质的。通过表型转换(一种称为上皮可塑性的过程)，上皮肿瘤细胞可变成间充质细胞，反之亦然。上皮细胞在顶端-基底方向通常是极性的，与在与极性垂直的平面上的相邻细胞附着在一起，并且在极性方向上是不动的。相比之下，间充质细胞没有极性，不与邻接细胞形成紧密的相互作用，并且是能动的。在成年动物中，上皮细胞和间充质细胞在一种状态或另一种状态下保持稳定；也就是说，上皮细胞不改变其性质和变成间充质细胞。然而，在发育期间，早期胚胎的上皮细胞产生所有3种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)，其包括间充质细胞(Hay,E.D.等,Am.J.KidneyDis.1995,26,678-690)。因此，这些早期胚细胞具有在上皮和间充质状态间转化的能力。胚胎显示进行上皮-间充质转化(EMT)以及间充质-上皮转化(MET)(Acloque,H.等,J.Clin.Invest.2009,119,1438-1449)。上皮可塑性(EP)是指上皮细胞表型的可逆丧失，一种已知在癌转移期间发生的过程。在多项研究中该EP生物学与癌症转移风险和在EMT过程中间充质和/或干细胞性(stemness)性质的获得有关。EMT在癌症的多个临床前模型中与化学抗性、侵袭、内渗和扩散有关。导致上皮表型重新表达的MET过程，在发育和转移中也可能具有重大意义，并且在转移生态位中与肿瘤细胞的转移定居和存活有关。例如，在前列腺癌中，间充质生物标志物在前列腺癌细胞系、动物模型和患者肿瘤样本中在雄激素剥夺期间可上调。而且，这些生物标志物在睾酮替代时是可塑性恢复的，并且与转移倾向和化学抗性提高有关。间充质样肿瘤细胞可更好地促进局部肿瘤侵袭和内渗/外渗，但是上皮肿瘤细胞在转移生态位中对于最终的存活和增殖可能是必需的，说明了EP的双重性质在介导整个转移过程中的潜在关联性。循环肿瘤细胞(CTC)，其是从原发性肿瘤中剥离并在血流中循环的细胞，在肿瘤学中具有潜在的预后、预测和替代意义。CTC可能构成其它肿瘤(转移)在不同组织中的后续生长的种子。因此，CTC的检测可对患有癌症(例如转移性前列腺癌和乳腺癌)的受试者的总体生存和治疗意义提供诊断和/或预后。任何患者样品(例如血样)中CTC的数目可能非常少，这会使得检测困难。目前用于检测CTC的方法基于上皮细胞粘附分子(EpCAM)表达的检测，所述上皮细胞粘附分子是与上皮细胞有关的生物标志物。然而，在转移过程中，循环肿瘤细胞(CTC)可能失去其上皮表型，并获得不足以被现有的基于上皮的CTC技术俘获的间充质表型。在转移期间，肿瘤细胞可作为一系列上皮至间充质表型存在。CTC可失去其上皮表型，并获得间充质表型，这可能不被现有的基于上皮的CTC技术俘获，因此在其中细胞的EpCAM表达降低或丧失的情况下(例如在包括EMT的生物过程中)，导致CTC的不足以检测。由于CTC可在患有癌症的患者的疾病诊断、监测和预后中起作用，因此本领域需要克服检测技术中的任何缺点。最新证据表明，CELLSEARCH®和其它基于上皮的技术发现不了具有间充质表型的CTC。因此，需要不依赖现有俘获技术的俘获CTC的方法和系统，以及使CTC检测与癌症患者的疾病诊断、监测和预后关联的方法。专利技术概述一方面，本公开内容提供用于检测生物样品的循环肿瘤细胞(CTC)的方法，所述方法包括检测生物样品中的至少一种上皮间充质转化(EMT)生物标志物。一方面，本公开内容提供用于检测生物样品中的循环肿瘤细胞(CTC)的试剂盒，该试剂盒包含至少一种EMT生物标志物的抗体和使用说明书。一方面，本公开内容提供预测患有癌症的受试者对癌症疗程的响应性的方法，所述方法包括：测定至少一种EMT生物标志物表达的水平或存在以获得CTC的EMT生物标志物概况和/或任选基因表达模式；并根据EMT生物标志物概况和/或任选的基因表达模式预测受试者对癌症药物的响应性。在一些实施方案中，所述方法包括：测定受试者样品中至少一种EMT生物标志物表达的水平或存在以获得受试者的CTC中的生物标志物概况和任选基因表达模式；根据生物标志物概况和/或任选的基因表达模式鉴定癌症的类型，任选表征癌症的分期；并根据生物标志物模式、任选的基因表达模式、癌症类型或癌症分期的任一种预测受试者对癌症药物的响应性。这个方面的实施方案可包括使用应用于受试者样品中的至少一种EMT生物标志物，检测从血样俘获和计数的细胞数。表达EMT生物标志物的这些细胞从而使用EMT生物标志物俘获，然后可用于获得受试者的CTC中的基因表达模式；根据所获得的基因表达模式预测受试者对癌症药物的响应性，并检测这些CTC中其它生物标志物以助于指导该受试者的疗法。这些细胞还可用来测量特定EMT生物标志物或其它EMT生物标志物的水平。一方面，本公开内容提供采用传统的基于EpCAM的俘获方法和基于EMT标志物的俘获方法两者评价CTC的数目的方法。这种基于EMT的俘获可代替或补充现有的CTC俘获技术。使用EMT抗原俘获的这些CTC的进一步俘获、计数和表征可进一步在患有癌症的受试者中靶向递送癌症药物，其包括根据这种EMT生物标志物的基因表达概况或存在将与对至少一种EMT生物标志物有特异性的抗体连接的癌症药物或特效药给予受试者。一方面，本公开内容提供评估癌症受试者的预后以及允许可预测治疗响应性的CTC的进一步表征的方法，所述方法包括：测定受试者样品中的至少一种EMT生物标志物的表达的水平或存在以测定受试者中的CTC的数目并获得受试者的基因表达模式；根据所获得的基因表达或生物标志物概况模式提供受试者的预后。一方面，本公开内容提供用于监测进行治疗性治疗的受试者的癌症进展的方法，所述方法包括检测至少一种EMT生物标志物的表达的水平或表达的存在，在第一时间和第二时间取自受试者的血样中使用该方法量化所俘获的CTC；比较第一表达水平和第二表达水平；其中在第一样品和第二样品中至少一种EMT生物标志物的表达水平随时间推移的检出差异表明癌症进展状态的变化。一方面，本公开内容提供用于检测受试者的癌症的方法，所述方法包括测定与正常样品或对照样品相比受试者样品中表达至少一种EMT生物标志物的CTC的存在，其中至少一种EMT生物标志物的水平提高表明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从患者中分离、俘获或富集循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括：a) 从患者中获得生物样品；b) 获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相‑俘获结合蛋白复合体；c) 使生物样品与固相‑俘获结合蛋白复合体接触足以使固相‑俘获结合蛋白复合体与循环肿瘤细胞上的至少一种上皮‑间充质转化(EMT)生物标志物结合以形成固相‑俘获结合蛋白‑循环肿瘤细胞复合体的一段时间；和d) 通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒‑俘获结合蛋白复合体中分离固相‑俘获结合蛋白‑循环肿瘤细胞复合体，从而分离、俘获或富集循环肿瘤细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.02.02 US 61/760042;2013.03.28 US 61/8063581.至少一种俘获结合蛋白在制备用于从患有前列腺癌的患者中分离、俘获或富集循环肿瘤细胞的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括：a)从所述患者中获得生物样品；b)获得所述至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体，并且其中所述俘获结合蛋白为上皮-间充质转化(EMT)生物标志物俘获抗体；c)使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以使固相-俘获结合蛋白复合体与循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物结合以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间，其中所述EMT生物标志物是OB-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白的至少一种；d)通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而分离、俘获或富集循环肿瘤细胞；和e)证实循环肿瘤细胞，其中证实循环肿瘤细胞包括DAPI染色、β-联蛋白检测、CD45检测和CD31检测，其中如果DAPI染色为阳性，β-联蛋白表达为阳性，CD45表达为阴性，CD31表达为阴性，则所述循环肿瘤细胞得到证实并且具有间充质表型。2.至少一种俘获结合蛋白在制备用于测定或鉴定患有前列腺癌的患者的循环肿瘤细胞的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括：a)从所述患者中获得生物样品；b)获得所述至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体，并且其中所述俘获结合蛋白为上皮-间充质转化(EMT)生物标志物俘获抗体；c)使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以使固相-俘获结合蛋白复合体与循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物结合以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间，其中所述EMT生物标志物是OB-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白的至少一种；d)通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而测定或鉴定循环肿瘤细胞；和e)证实循环肿瘤细胞，其中证实循环肿瘤细胞包括DAPI染色、β-联蛋白检测、CD45检测和CD31检测，其中如果DAPI染色为阳性，β-联蛋白表达为阳性，CD45表达为阴性，CD31表达为阴性，则所述循环肿瘤细胞得到证实并且具有间充质表型。3.至少一种俘获结合蛋白在制备用于从患有前列腺癌的患者中分离或俘获完整细胞的方法的试剂盒中的用途，其中所述细胞为β-联蛋白阳性、DAPI阳性和CD45阴性，所述方法包括：a)从所述患者中获得生物样品；b)获得所述至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体，并且其中所述俘获结合蛋白为上皮-间充质转化(EMT)生物标志物俘获抗体；c)使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以使固相-俘获结合蛋白复合体与完整细胞上的至少一种EMT生物标志物结合以形成固相-俘获结合蛋白-完整细胞复合体的一段时间，其中所述EMT生物标志物是OB-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白的至少一种；d)通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-完整细胞复合体，从而分离或俘获完整细胞；和e)证实循环肿瘤细胞，其中证实循环肿瘤细胞包括DAPI染色、β-联蛋白检测、CD45检测和CD31检测，其中如果DAPI染色为阳性，β-联蛋白表达为阳性，CD45表达为阴性，CD31表达为阴性，则所述循环肿瘤细胞证实并且具有间充质表型。4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述EMT生物标志物是OB-钙黏着蛋白。5.权利要求1-3中任一项的用途，所述方法还包括测定至少一个前列腺癌特异性基因组事件的存在与否。6.权利要求5的用途，其中所述至少一个前列腺癌特异性基因组事件选自雄激素受体扩增、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)丧失、跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)基因和ETS相关(ERG)基因的基因融合，及其组合。7.权利要求5的用途，其中所述测定步骤通过荧光原位杂交(FISH)进行。8.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述生物样品包括来自生物体的组织样品或流体样品。9.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述生物样品包括血液。10.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述固相是微粒。11.权利要求10的用途，其中所述微粒是磁性或顺磁性的。12.至少一种俘获结合蛋白在制备用于测定和治疗受试者的前列腺癌的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括：a)从所述受试者中获得生物样品；b)获得所述至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体，并且其中所述俘获结合蛋白为上皮-间充质转化(EMT)生物标志物俘获抗体；c)使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以使固相-俘获结合蛋白复合体与循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物结合以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间，其中所述EMT生物标志物是OB-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白的至少一种；d)通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体；e)测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平；f)将循环肿瘤细胞的水平与循环肿瘤细胞的参比水平进行比较；g)如果循环肿瘤细胞的水平高于循环肿瘤细胞的参比水平，检测受试者的前列腺癌；和h)将抗前列腺癌疗法给予鉴定为患有前列腺癌的受试者；其中测定固相...

【专利技术属性】
技术研发人员：GC劳，MC康奈利，MA加西亚布兰科，AJ阿姆斯特隆，RL比廷，
申请(专利权)人：杜克大学，
类型：发明
国别省市：美国;US