本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及到一种体外诱导脂肪来源的间充质干细胞(ADSCs)向成熟肝细胞(iHeps)分化的方法。该方法包括的步骤为：分离出ADSCs；体外诱导培养ADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为3个阶段：内胚层诱导阶段；成肝诱导阶段；肝细胞的成熟阶段。使用本发明专利技术的诱导分化方法，只需要九天左右的时间就足够产生具有肝细胞形态，基因表达及功能的肝细胞，是目前用时最短的肝细胞分化方法。这将有利于临床治疗方案的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及到一种体外诱导脂肪来源的间充质干细 胞（ADSCs)向成熟肝细胞（iH印s)分化的方法。
技术介绍
肝脏是一个调节多种生理过程的关键器官。肝脏疾病，如爆发性肝损伤，是导致死 亡的重要原因。原位肝移植（OLT)是目前治疗终末期肝脏疾病的唯一方法，但由于免疫排 斥等副作用及其肝脏供体的短缺限制了肝移植的临床应用。肝细胞移植是治疗肝功能不全 的整体肝移植的替代疗法；虽然原代肝细胞可以从供体肝脏中分离得到，但每次移植需要 1~5XIO9个肝细胞，这就需要获得大量的供体肝或大量体外扩增原代肝细胞。供体肝脏 的缺乏和原代肝细胞体外扩增困难等原因使得获得充足的可用于细胞治疗的肝细胞非常 困难。为了解决目前这种窘境，迫切需要可快速产生大量肝细胞的新方法。 过去几年，发现了多种可用于治疗肝脏疾病的肝外细胞群，其中具有多向分化潜 能和半无限增殖能力的间充质干细胞（MSCs)就是一种重要的具有潜在应用价值的细胞。 间充质干细胞可从骨髓、脂肪、脐带血、羊膜液、头皮、胎盘等多种组织中获得。其中，脂肪来 源的MSCs(ADSCs)被认为是最有应用前景的一类间充质干细胞，其在脂肪组织的占比介于 I:100到I:500之间，远高于骨髓间充质干细胞在骨髓中所占比例，在再生医学中有良好的 应用前景。ADSCs来源充足，易得到，创伤小，可取材于患者自身的脂肪组织，这样就避免了 免疫排斥反应，也解决了伦理问题等的障碍。已有研究表明ADSCs在体外具有诱导分化成 肝细胞的潜力。目前的技术由ADSCs向肝细胞诱导分化都需要大约1个月的时间，使得这些诱导 分化方法并不适用于实际临床应用。而临床应用需要尽可能缩短体外诱导分化的时间。因 此，开发新的能在短时间内将ADSCs高效地诱导成为成熟肝细胞（iH印s)的方法是本领域 的一个难题。
技术实现思路
本专利技术要求解决的技术问题是现有ADSCs诱导成为iHeps的方法耗时长，效率低 的缺陷。 本专利技术解决技术问题的技术方案是提供一种新的体外诱导ADSCs向iHeps分化的 方法。该方法包括以下步骤：a、从离体脂肪组织中分离出ADSCs;b、体外诱导ADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为3个阶段： 内胚层诱导阶段：在步骤a分离得到的ADSCs中加入含有50~200nMIDEl和1~ 5yMCHIR99021 的RPMI-1640 培养基或者含有 50~200nMIDEl和 1 ~5yMCHIR99021 的DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时间为20~28小时。 成肝诱导阶段：在完成内胚层诱导后的细胞中加入含有50-200nMIDE和 10-30ng/mLFGF4的 RPMI-1640培养基或者含有50-200nMIDE和10-30ng/mLFGF4的 DMEM/F12中培养基诱导培养64~80小时。 肝细胞的成熟阶段：在完成成肝诱导后的细胞中加入肝细胞生长因子（HGF)至 100-200ng/mL、加入纤维母细胞生长因子4(FGF4)至10-30ng/mL、加入抑瘤素M(OsM)至20-40ng/mL、加入地塞米松（Dex)至1.5~3X10 5mol/L以及加入ITS预混通用培养添加 物的Williams' E培养基中诱导培养，培养时间为112~136小时。 进一步的，上述方法骤b所述内胚层诱导阶段为将步骤a分离得到的ADSCs在加 入IDEl至IOOnM和CHIR99021至3 yM的RPMI-1640培养基或者DMEM/F12培养基中诱导 培养，诱导时间为24小时。 进一步的，上述方法步骤b所述成肝诱导阶段为将完成内胚层诱导的ADSCs在加 入IDEl至IOOnM和加入FGF4至20ng/mL的RPMI-1640培养基或者DMEM/F12中培养基诱 导培养72小时。 进一步的，步骤b所述成肝诱导阶段为将完成肝诱导阶段的ADSCs在加入肝细胞 生长因子（HGF)至150ng/mL、加入纤维母细胞生长因子4至20ng/mL纤维母细胞生长因子 4(FGF4)、加入抑瘤素M(OsM)至30ng/mL、加入地塞米松（Dex)至1. 5~3X10 5mol/L以及 ITS预混通用培养添加物的Williams'E培养基中诱导培养，培养时间120小时。 其中，上述方法中分离得到的ADSCs在培养3-7代后再按步骤b所述方法进行诱 导培养。 其中，上述方法中所述ADSCs在进行步骤b之前接种于I型胶原包被的培养皿中 进行后继诱导培养。 其中，上述方法中所述ADSCs接种于I型胶原包被的培养皿中，当细胞长满培养 皿底部后按步骤b的进行诱导培养。 本专利技术方法适用于动物的ADSCs诱导为iHeps。尤其是适用于啮齿类动物的ADSCs 诱导为iHeps。优选的，适用于大鼠的ADSCs。 本专利技术的优点在于：使用本专利技术的分化方法，只需要八到十天左右的时间就足够 产生具有肝细胞形态，基因表达及功能的肝细胞，是目前用时最短的肝细胞分化方法。本 专利技术方法能获得ADSCs来源的肝细胞，使来自患者的自体脂肪组织的细胞治疗肝病成为可 能，从而可以避免异体细胞的免疫排斥反应。其次，诱导过程快速而高效，这将有利于临床 治疗方案的应用。此外，根据诱导分化后的肝细胞的功能分析，使用这种分化方法获得的细 胞作为肝细胞的资源，将有利于肝细胞移植的发展。因此，该方法为ADSCs在肝脏疾病细胞 治疗中的应用迈出了重要的一步。【附图说明】 图1为诱导培养后的细胞形态图片。 图2为对诱导结束的细胞进行流式检测的结果。 图3为肝细胞特异性基因表达检测结果。 图4为使用诱导得到的iHeps进行改善0：14诱导的急性肝损伤的功能试验结果。【具体实施方式】 本专利技术方法具体可按以下步骤进行。 -、ADSC的分离、培养与扩增。 ADSC的分离、培养与扩增可按常规方法进行。 作为参考，本专利技术以大鼠为例，介绍以下具体方法： 大鼠脂肪间充质干细胞的分离：按0. 35-0. 4ml/100g体重，腹腔注射10%水合氯 醛麻醉大鼠，75%酒精浸泡lOmin。于超净台上无菌分离其腹股沟脂肪垫，在冷D-Hank's 液中漂洗3次，去除肉眼可见的纤维成分和血管，将其剪碎成Imm3左右的小颗粒，然后转入 离心管并加入0. 1%I型胶原酶（每克脂肪组织加2-5mL)，置于37°C振荡消化1小时。加 入等量的4°C预冷的含10%血清（FBS)的DMEM-LG培养基终止消化后，将离心管管上下颠 倒振荡几次进一步加速组织块离散，并用纱布过滤去除组织碎片。过滤液于4°C1500rpm离 心10分钟，重复离心过程并弃去上清。将沉淀细胞用细胞裂解缓冲液重悬，室温静置IOmin 以裂解红细胞。4°(：下1500印111离心10111111，弃上清后用含10%血清$83)的01^11-1^培养 基重悬细胞于75cm2培养皿中，并放置于5%CO2, 37°C培养箱中培养。1天后，用Hank's平 衡盐溶液漂洗培养皿2-3次，清除未贴壁细胞，加入含10 %血清（FBS)的DMEM-LG培养基继 续培养。每2天换培养液1次，直至细胞达到覆盖80-90%培养皿底后用0. 25%胰酶溶液 消化进行细胞传代。传代3-7代后用于诱导培养。 二本文档来自技高网...
【技术保护点】
体外诱导ADSCs向iHeps分化的方法，其特征包括以下步骤：a、从离体脂肪组织中分离出ADSCs；b、体外诱导培养ADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为以下3个阶段：内胚层诱导阶段：在步骤a分离得到的ADSCs中加入含有50～200nM IDE1和1～5μΜ CHIR99021的RPMI‑1640培养基或者含有50～200nM IDE1和1～5μΜ CHIR99021的DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；成肝诱导阶段：在完成内胚层诱导后的细胞中加入含有50‑200nM IDE和10‑30ng/mLFGF4的RPMI‑1640培养基或者含有50‑200nM IDE和10‑30ng/mL FGF4的DMEM/F12中培养基诱导培养64～80小时；肝细胞的成熟阶段：在完成成肝诱导后的细胞中加入肝细胞生长因子(HGF)至100‑200ng/mL、加入纤维母细胞生长因子4(FGF4)至10‑30ng/mL、加入抑瘤素M(OsM)至20‑40ng/mL、加入地塞米松(Dex)至1.5～3×10‑5mol/L以及加入ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中诱导培养，培养时间为120～144小时。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓洪新，邓节，徐芬，付艳丽，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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