一种筛选二肽基肽酶四抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选二肽基肽酶四抑制剂的方法，所述方法包括：配制酶促反应缓冲液、底物溶液、二肽基肽酶四溶液、显色剂溶液和供试品溶液；将供试品溶液点样于薄层板上，挥去溶剂后或使用适宜的展开剂展开晾干后浸渍于底物溶液中，然后取出、挥干溶剂，再浸渍于二肽基肽酶四溶液中，在10～50℃进行酶促反应10～60分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂后浸渍于亚硝酸钠稀盐酸溶液中，再取出挥干溶剂后浸渍于N-1-萘乙二胺水溶液中进行显色反应；在可见光下进行检视：出现的红色背景下的白色或淡黄色斑点即为二肽基肽酶四抑制剂。本发明专利技术为筛选二肽基肽酶四抑制剂的研究提供了一种方便、快捷地筛选方法。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选二肽基肽酶四抑制剂的方法
本专利技术是涉及一种筛选二肽基肽酶四抑制剂的方法，具体说，是涉及一种利用薄层色谱-生物自显影技术筛选二肽基肽酶四抑制剂的方法。
技术介绍
二肽基肽酶四(DipeptidylpeptidaseIV，DPP-IV)是近年来发现的二型糖尿病药物开发的新型靶点。DPP-IV是位于细胞表面的一种丝氨酸肽酶(serinepeptidase)，广泛存在于肾脏、胃肠道、结缔组织、淋巴结等组织中，其催化活性中心位于胞外分子C末端区域，凡N端第二位上存在脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)的多肽是该酶发挥活性的主要底物。胰高血糖素类肽-1(GLP-1)在体内主要由肠道L细胞分泌，具有延迟胃排空、促进饱胀感、抑制肝糖合成、提高胰岛素分泌、促进细胞分化增殖、抑制凋亡、从而达到降血糖作用，但是由于GLP-1在体内很快就能被DPP-IV为主的酶降解而失活，半衰期小于2分钟，故难于发挥降糖作用。DPP-IV抑制剂可以竞争性地结合DPP-IV活化部位，从而改变DPP-IV的构象，降低其催化活性，故能有效延长GLP-1半衰期，增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌，调节血糖浓度，从而达到降血糖作用。所以寻找DPP-IV抑制剂已成为治疗二型糖尿病新药研究的一个热点。现有技术中，筛选DPP-IV抑制剂的高通量方法主要有两种：一种是以带荧光基团(AMC/AFC)的Gly-Pro-AMC/AFC为底物的荧光底物法，另一种是以甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺(Gly-Pro-PNA)为底物的发色底物法。其中，发色底物法以其步骤简便、不需要特殊检测仪器、反应时间长、不易受操作影响等优点广泛用于DPP-IV抑制剂的筛选。其反应原理是在碱性条件下，DPP-IV催化底物Gly-Pro-PNA水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者在波长405nm处有特征性吸收峰，通过酶标仪在405nm处测得的吸光度大小即发色基团PNA生成量多少来反映酶活性高低。由于上述两种DPP-IV抑制剂的筛选方法都要求受试药物必须溶于水，因此局限了对天然产物的筛选，因为天然产物中很多活性成分为脂溶性物质，即便是极性较大的化合物，多数也难与水直接相溶，而加入助溶剂会产生不可靠的结果。例如，曾有报道称DPP-IV的活性由于加入1％的DMSO而降低了50％。此外，很多助溶剂成分具有发色基团或在405nm区域有吸收峰，极易出现假阳性或者假阴性的可能，因此，上述两种方法在筛选DPP-IV天然抑制剂的应用中受到极大限制，故限制了从天然产物中筛选DPP-IV抑制剂的研究。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种筛选二肽基肽酶四抑制剂的方法，利用薄层色谱-生物自显影技术，实现快速、高通量、高灵敏度和专属性地从天然产物或单体化合物中筛选二肽基肽酶四抑制剂。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种筛选二肽基肽酶四抑制剂的方法，包括如下步骤：a)配制酶促反应缓冲液、底物溶液、二肽基肽酶四溶液、显色剂溶液和供试品溶液，备用；所述的酶促反应缓冲液选用pH值为6.5～10.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；所述的底物溶液选用浓度为0.01～10mg/mL的甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺乙醇水溶液；所述的二肽基肽酶四溶液选用含二肽基肽酶四的活性浓度为0.1～20U/L的酶促反应缓冲液；所述的显色剂溶液为亚硝酸钠稀盐酸溶液和N-1-萘乙二胺水溶液；b)将供试品溶液点样于薄层板上，挥去溶剂后备用或使用适宜的展开剂展开后取出、晾干备用；c)将经步骤b)处理后的薄层板浸渍于底物溶液中，然后取出、挥干溶剂；d)将经步骤c)处理后的薄层板浸渍于二肽基肽酶四溶液中，在10～50℃进行酶促反应10～60分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂；e)将经步骤d)处理后的薄层板先浸渍于亚硝酸钠稀盐酸溶液中，取出挥干溶剂后再浸渍于N-1-萘乙二胺水溶液中进行显色反应；f)对经步骤e)显色后的薄层板在可见光下进行检视：出现的红色背景下的白色或淡黄色斑点即为二肽基肽酶四抑制剂。作为优选方案，所述的酶促反应缓冲液由三羟甲基氨基甲烷与盐酸形成，其中的三羟甲基氨基甲烷的含量为80～90mg/mL。作为优选方案，所述的乙醇水溶液的体积分数为40～60％。作为优选方案，所述的二肽基肽酶四溶液选用含二肽基肽酶四的活性浓度为5～15U/L的酶促反应缓冲液。作为优选方案，所述的亚硝酸钠稀盐酸溶液中的亚硝酸钠的质量百分比浓度为0.01～2％，盐酸的质量百分比浓度为1～5％。作为优选方案，所述的N-1-萘乙二胺水溶液的质量百分比浓度为0.005～0.2％。作为优选方案，所述的薄层板选用硅胶板、聚酰胺板、纤维素板中的任意一种。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果和显著性进步：1)无需复杂的仪器和设备，操作简单，实验耗费低，适合一般实验室操作，而且灵敏度和专属性高于常规筛选方法；2)筛选结果形象直观，易于辨识和记忆；3)筛选过程以薄层板为媒介，不受溶剂和供试品浓度的限制，使得受试样品的选择范围更为广泛；总之，本专利技术提供了一种可方便、快捷地筛选二肽基肽酶四抑制剂的方法，尤其为从天然物质中筛选出具有二肽基肽酶四抑制活性成分的研究提供了一条理想途径，具有显著性应用价值。附图说明图1为实施例1采用本专利技术的筛选方法对抑二肽素A抑制二肽基肽酶四活性能力的检视结果。图2为实施例2采用本专利技术的筛选方法对抑二肽素A抑制二肽基肽酶四活性能力的检测限测试结果。图3为实施例3采用本专利技术的筛选方法对维格列汀抑制二肽基肽酶四活性能力的检视结果。图4为实施例4采用本专利技术的筛选方法对西他列汀抑制二肽基肽酶四活性能力的检视结果。图5为实施例5采用本专利技术的筛选方法对阿卡波糖抑制二肽基肽酶四活性能力的检视结果。图6为实施例6采用本专利技术的筛选方法对木犀草素抑制二肽基肽酶四活性能力的检视结果。图7为实施例7采用本专利技术的筛选方法对蛇床子提取物抑制二肽基肽酶四活性能力在不同检视条件下的检视结果对比；其中：A图是在366nm波长光照下的检视结果，B图是在可见光下的检视结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步阐述：实施例1一、溶液配制酶促反应缓冲液的配制：将0.85g三羟甲基氨基甲烷溶于50mL水中，用盐酸调节pH值至8.2，然后加水定容至100mL，再置于2～4℃冰箱中保存备用。底物溶液的配制：将甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺溶于50vol％的乙醇水溶液中，配制成甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺的含量为0.15mg/mL的溶液，然后置于2～4℃冰箱中保存备用。二肽基肽酶四溶液的配制：将猪肾二肽基肽酶四加入上述酶促反应缓冲液中，配制成二肽基肽酶四的活性浓度为10U/L的二肽基肽酶四溶液。显色剂溶液的配制：亚硝酸钠稀盐酸溶液：将亚硝酸钠固体溶于稀盐酸(由1mL37％的浓盐酸稀释至10mL得到)中，配制成亚硝酸钠的质量百分比浓度为0.5％的亚硝酸钠稀盐酸溶液；N-1-萘乙二胺水溶液：将N-1-萘乙二胺粉末溶于水中，配制成N-1-萘乙二胺的质量百分比浓度为0.05％的水溶液。供试品溶液的配制：将抑二肽素A(Diprotin-A)粉末溶于上述酶促反应缓冲液(pH为8.2)中，配制成抑二肽素A的含量为0.15mg/mL的供试品溶液。二、对二肽基肽酶四的抑制活性的检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选二肽基肽酶四抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)配制酶促反应缓冲液、底物溶液、二肽基肽酶四溶液、显色剂溶液和供试品溶液，备用；所述的酶促反应缓冲液选用pH值为6.5～10.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；所述的底物溶液选用浓度为0.01～10mg/mL的甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺乙醇水溶液；所述的二肽基肽酶四溶液选用含二肽基肽酶四的活性浓度为0.1～20U/L的酶促反应缓冲液；所述的显色剂溶液为亚硝酸钠稀盐酸溶液和N‑1‑萘乙二胺水溶液；b)将供试品溶液点样于薄层板上，挥去溶剂后备用或使用适宜的展开剂展开后取出、晾干备用；c)将经步骤b)处理后的薄层板浸渍于底物溶液中，然后取出、挥干溶剂；d)将经步骤c)处理后的薄层板浸渍于二肽基肽酶四溶液中，在10～50℃进行酶促反应10～60分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂；e)将经步骤d)处理后的薄层板先浸渍于亚硝酸钠稀盐酸溶液中，取出挥干溶剂后再浸渍于N‑1‑萘乙二胺水溶液中进行显色反应；f)对经步骤e)显色后的薄层板在可见光下进行检视：出现的红色背景下的白色或淡黄色斑点即为二肽基肽酶四抑制剂。

【技术特征摘要】
1.一种筛选二肽基肽酶四抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)配制酶促反应缓冲液、底物溶液、二肽基肽酶四溶液、显色剂溶液和供试品溶液，备用；所述的酶促反应缓冲液选用pH值为6.5～10.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；所述的底物溶液选用浓度为0.01～10mg/mL的甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺乙醇水溶液；所述的二肽基肽酶四溶液选用含二肽基肽酶四的活性浓度为0.1～20U/L的酶促反应缓冲液；所述的显色剂溶液为亚硝酸钠稀盐酸溶液和N-1-萘乙二胺水溶液；b)将供试品溶液点样于薄层板上，挥去溶剂后备用或使用适宜的展开剂展开后取出、晾干备用；c)将经步骤b)处理后的薄层板浸渍于底物溶液中，然后取出、挥干溶剂；d)将经步骤c)处理后的薄层板浸渍于二肽基肽酶四溶液中，在10～50℃进行酶促反应10～60分钟；反应完成后，取出薄层板、挥干溶剂；e)将经步骤d)处理后的薄层板先浸渍于亚硝酸钠稀盐酸溶液中，取出挥干溶剂后再浸渍于N-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷丽华，廖立平，胡惠军，侴桂新，王峥涛，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：上海;31