本发明专利技术涉及一种Lambda干扰素突变体，将干扰素lambda1的第123位脯氨酸突变为丝氨酸，得到一种新型的突变体干扰素Lambda，所述的突变体干扰素Lambda具有相对突变前更好的稳定性，本发明专利技术还涉及该Lambda干扰素突变体的聚乙二醇衍生物及其用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及IFN-A1突变体、其聚乙二醇衍生物及其制备方法，以及包含所述 IFN-X1突变体或该突变体的聚乙二醇衍生物在预防或治疗病毒性疾病、肿瘤方面的应用。
技术介绍
干扰素是一类重要的家族性细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖和免疫调 节作用。 迄今，已经鉴定到6种形式的干扰素，它们分为三个大组。所谓的"I型"干扰素包 括干扰素ct、干扰素0、干扰素《、干扰素S、干扰素T。目前，干扰素Y和干扰素a的 一个亚类是仅有的II型干扰素。III型干扰素是最近发现的一类细胞因子家族，包括干扰 素X1、入2和入3,也称为IL-28A、IL-28B和IL-29IL-28A、IL-28B和IL-29包含最近发现的新蛋白家族，所述蛋白质家族与I型干 扰素有序列同源性，并与IL-10有基因序列的同源性。该新家族在共同所有的PCT申请 W002/086087 和Sh印pard等，NatureImmunol. 4:63-68, 2003(全文都纳入本文参考）中有 详细的描述。从功能上说，IL-28和IL-29类似于I型干扰素，均能诱导细胞中的抗病毒状 态，与I型干扰素不同的是，它们不显示出抗某些B细胞系的抗增殖活性。 野生型几-29(干扰素X1)基因编码200个氨基酸多肽，该蛋白质成熟氨基酸序 列显示在SEQIDNO: 1中，编码本文所述的IL-29多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多 核苷酸显示在SEQIDN0:2中。IL-29的螺旋预测如下：螺旋A有氨基酸残基30 (Ser)至 44 (Leu)所定义；螺旋B由氨基酸残基57 (Asn)至65 (Val)所定义；螺旋C有氨基酸残基 70 (Val)至85 (Ala)所定义；螺旋D由氨基酸残基92 (Lys)至111 (Gln)所定义；螺旋E由 氨基酸残基118 (Thr)至139 (Lys)所定义；而螺旋F由氨基酸残基144 (Gly)至170 (Leu) 所定义。已知IL-29分子具有5个半胱氨酸残基（PCT申请W002/086087W002/02627)，基于 多重比对进行的IL-29的进一步分析预测，氨基酸残基第49和145位，及第112和171位 的半胱氨酸将形成分子内二硫键，第15位的半胱氨酸是游离的，可以形成分子间二硫键。 无论是I型干扰素、II型干扰素还是III型干扰素，作为蛋白质药物，由于稳定性 差、血浆清除率高，体内半衰期短，易产生抗原抗体等，在临床治疗中很大的限制。基因工程 技术使大规模合成人重组蛋白成为可能，工程蛋白通过改变野生蛋白序列中的某个或某几 个氨基酸，以获得相对更为稳定、比活性更高的重组蛋白，并降低其免疫原性，这在一定程 度上解决了异源蛋白引起的不稳定或免疫原性问题。 尽管这样，还无法克服血浆清除快和生物利用度低等缺点，这些缺点造成的结果 是：需频繁注射干扰素才能达到有效血浆治疗浓度；而且，每次注射后均会导致血药浓度 的较大波动，形成药物浓度的峰值和谷值。这样就可能增加了治疗费用以及给药不便和不 良反应的风险。因此，人们试图采用各种药物传递技术来提高蛋白质药物的疗效。 蛋白药物的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍 在临床治疗上的应用聚乙二醇修饰蛋白质的技术是近年来发展起来的一种用于改进蛋白 质类药物体内药动学性质的新技术。它是将活化的聚乙二醇分子（PEG)键合到蛋白质分子 表面上，从而影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变，如：化学 稳定性增加，抵抗蛋白酶水解能力提高，免疫原性和毒性降低消失，体内半衰期延长，血浆 清除率降低等等。 专利技术概述IFN-A1上有多处氨基酸可供进行突变，但这些氨基酸序列的改变应当考虑 IFN-A1的折叠及空间结构不受影响、并至少得到可以保持相当于野生型IFN-A1活性的 突变体。本专利技术的目的是提供一种在第123位氨基酸进行突变得到的一种新型的突变体 IFN-A1，将第123位的Pro突变为Ser，该突变体相对于野生型IFN-A1，活性更强、稳定性 更好。 本专利技术提供制备可溶性IFN-X1突变体的方法，该方法通过先构建设计IFN-入1 突变体引物，构建获得突变体基因，将所得基因插入到表达载体，将所得的载体转入到宿主 大肠杆菌中，得到相应的表达工程菌，再进行发酵和诱导表达、包涵体变性和复性，得到可 溶性IFN-入1突变体。 所需的蛋白质从可溶性细胞质部分，可溶性周质部分、培养基的可溶性部分以及 包涵体中回收和纯化，可使用从培养基、细胞质、周质部分以及包涵体中回收和纯化蛋白质 的任何方法，这些回收和纯化方法是已知的或本领域的技术人员容易确定的，包括，但不限 于，离心，过滤，透析，层析（包括分子排阻层析）等方法。回收和纯化所需蛋白质的合适方 法部分取决于蛋白质的特性和目的用途。 为实现所采取的技术方案是利用蛋白工程技术，对SEQIDNO:1所示的氨基酸序 列进行定点突变，将123位的Pro突变为Ser，具体方法是： 1)利用体外定点突变技术获得编码目的蛋白的重组基因； 2)将此重组基因插入到表达载体中获得可编码重组蛋白的重组质粒，所述表达载 体包括但不限于pET-23b; 3)将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞获得可稳定表达目的蛋白的工程菌，所述 大肠杆菌感受态细胞包括但不限于BL21(DE3); 4)工程菌以包含体形式表达的目的蛋白。表达产物包涵体形式存在，表达量占菌 体总蛋白的40%以上，重组蛋白的纯化依次采用Blue染料亲和层析、铜离子亲和层析、CM 弱阳离子交换层析三步纯化工艺，可以得到高纯度的重组目的蛋白IFN-A1突变体。 本专利技术的个目的是提供如上所述的IFN-X1突变体的聚乙二醇衍生物及其制备 方法，通过硫醇反应使聚乙二醇（PEG)试剂与IFN-A1中的游离半胱氨酸残基反应获得特 异性偶联物，所得产物中，PEG实现在游离半胱氨酸定点修饰，得到的PEG-IFN-X1突变体。 较未PEG化的IFN-M相比，所得的PEG-IFN-M具有稳定性提高、免疫原性减弱。 一般来说，PEG化蛋白质方法类似W09412219(Cox和McDermott)和W09422466(Cox 和Russell)中所述的方法，并略加改良，本文引用这两篇文献以供参考。将含游离半胱氨 酸的多肽或蛋白质与过量的"巯基化PEG"相接触（一般PEG:蛋白质或多肽的摩尔比为 1:1、5:1、10:1、和50:1)搅拌进行反应，反应条件中优选的温度是4°C到37°C;优选的pH范 围可以从6. 5到9. 5,但更优选为7. 5到8. 5。使用SDS-PAGE测定分子量的改变可检测蛋 白质的PEG化，一般认为产生大量单PEG化产物而不产生二PEG化产物的PEG的最低量是 最佳的（一般认为80%转变成单PEG化产物是较好的）。 本专利技术半胱氨酸以形成"PEG化"蛋白质的"PEG部分"包括任何合适的多聚 体，例如，线性或带支链的多元醇。优选的多元醇是聚乙二醇，它是环氧乙烷单元组成 的合成多聚体，可改变环氧乙烷单元以便通过大小排阻层析获得表观分子量范围大约为 3, 000-70,OOODa的PEG化蛋白质变异体。PEG部分的大小直接影响其循环半衰期。因此， 可通过改变PEG部分的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种IFN‑λ1突变体，其特征在于所述突变体的氨基酸序列的第123位的Pro突变为Ser。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田硕，杨璐，潘海，
申请(专利权)人：北京凯因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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