通过大肠杆菌和钝齿棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，将来源于Bacillus cereus的精氨酸酶成功在C.crenatum SDNN403中表达。酶活测定结果表明，原始菌不具有精氨酸酶的活性，而重组工程菌的精氨酸酶酶活达到24.3U/mg。以此工程菌全细胞菌体作为生物催化剂，以L-精氨酸作为底物，同时基于精氨酸酶酶学性质，确定了最佳的反应温度为40℃和pH为9.0。将200ml LBG培养的重组菌菌体重新悬浮于200ml的底物缓冲液中，在最佳的转化条件下进行转化法生产L-鸟氨酸。8h后可以得到149.2g/L的L-鸟氨酸，底物L-精氨酸的摩尔转化率达到99.5％。本发明专利技术方法生产L-鸟氨酸具有效率高，专一性强，能耗低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到精氨酸酶基因的克隆表达获得重组工程菌，同时将该工程菌应用于 L-鸟氨酸的生产，属于生物工程和生物
技术背景 L-精氨酸酶（E.C. 3.5.3. 1)是尿素循环中的一种关键酶，其催化L-精氨酸形 成L-鸟氨酸和尿素，精氨酸酶广泛存在于各种动植物和微生物体内，来源于Bacillus brevis，Bacillussubtilis和Bacillusthuringiensis等微生物的精氨酸酶已经获得较 好的研究。鸟氨酸是一种碱性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有机溶剂。鸟氨酸接受 二分子NH/和一分子CO 2形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被 水解成鸟氨酸和尿素。 L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，是精氨酸和脯氨酸合成的重要前体物 质。同时L-鸟氨酸是人体内尿素循环的重要中间代谢产物，因此其对肝脏的解毒功能具有 重要的保障作用。L-鸟氨酸能够刺激体内生长激素的分泌，促进蛋白质的合成以及糖类和 脂质的分解代谢作用。L-鸟氨酸和其他氨基酸一起制成的复方氨基酸有很好的保肝护肝以 及激发病态下肝脏的活力的作用。联合使用L-鸟氨酸和苯乙酸能有效治疗肝性脑病，特别 是对于鸟氨酸循环障碍的患者，L-鸟氨酸能通过促进谷氨酰胺的合成和排泄来稳定的降低 患者血氨浓度。鸟氨酸a-酮戊二酸盐是很好的临床营养剂，促进外科创伤病人的恢复，改 善慢性营养不良，改善免疫功能。同时鸟氨酸和苹果酸盐和柠檬酸盐合用能够改善食品和 饮料的口味，减少苦味。在欧洲、美国以及日本，L-鸟氨酸都是作为膳食药物来销售的。 工业上L-鸟氨酸的合成包括化学合成法、微生物发酵法和L-精氨酸水解法。化 学合成作为早期L-鸟氨酸的生产方法，一般以丙烯醛、氰化氢、氨气、C02为原料合成L-鸟 氨酸。但效果并不是很理想，主要表现在于合成的步骤繁琐，产物得率低，而且得到的产物 是L-鸟氨酸和D-鸟氨酸的混合物，为后期的分离纯化带来很大的困难。同时化学法合成 L-鸟氨酸由于其环境的危害性，越来越不被现代工业所接受。生物合成法相对化学合成法 具有生产成本较低，环境污染小等优点而受到重视。微生物发酵生产L-鸟氨酸主要是通过 诱变或者基因工程的方法获得L-鸟氨酸高产菌株，以较为便宜的葡萄糖甚至是淀粉等最 为初始原料合成L-鸟氨酸。在这方面日本起步较早，上世纪五六十年代就开始鸟氨酸生产 的研究，主要以诱变筛选为主。1957年kinoshita等首先报道了利用谷氨酸棒状杆菌的瓜 氨酸或精氨酸的突变株发酵生产鸟氨酸。此后，okumurahe Shibuya等人在这方面也做了 大量的工作总结出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸盐抗性的谷氨酸棒杆菌以及具有 精氨酸和瓜氨酸，以及霉酚酸抗性等标记的柠檬酸节杆菌突变株用于工业生产中。国内陈 宁、刘树庆等人在1999年开始研究鸟氨酸的生产，并以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过硫 酸二乙酯和紫外线诱变定向选育出一种鸟氨酸生产菌，并通过发酵优化使得鸟氨酸产量达 到9. 85g/L。近几年，随着代谢工程技术的兴起，通过代谢工程改造的方法，鸟氨酸的发酵生 产取得一定的进展，其中，中山大学蒋玲艳等人以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过表达异源 的谷氨酸脱氢酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，增加代谢流中NADPH的含量，使得L-鸟氨酸产 量得到提高，最终到14. 8g/L，而后蒋又通过代谢进化和代谢工程的方法，最后得到鸟氨酸 的产量为24.lg/L。通过发酵法进行鸟氨酸生产可以利用较简单的碳源，如葡萄糖等，成本 非常低廉，适合于工业的发展，但发酵周期一般都相对较长，而且发酵的产量较低对于后期 分离需要较高的技术需求。 L-精氨酸水解法生产L-鸟氨酸包括，碱水解法和酶水解法，特别是酶水解，由于 其反应效率高，产物转专一性高而受到越来越多的重视。近几年，国内有人开始尝试以精氨 酸为底物进行酶转化法生产L-鸟氨酸。北京化工大学徐焘，通过筛选得到一株精氨酸酶活 力较高的苏云金芽孢杆菌，以此细胞作为生物催化剂，以L-精氨酸为底物进行L-鸟氨酸 生产，并最终得到43. 57g/LL-鸟氨酸。而后张涛等人提取苏云金芽孢杆菌的精氨酸酶， 以精氨酸为底物，精氨酸酶纯酶作催化剂，并最终得到72.lg/L的精氨酸酶。宋伟等人构 建表达外源精氨酸酶的E.coliBL21，并以重组细胞为催化剂，L-精氨酸为底物，最终得到 112. 3g/L的L-鸟氨酸 本专利技术通过表达载体pXMJ19,实现了将来源于Bacillus cereus的精氨酸酶基因 argl成功在纯齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SDNN403(该菌株为本课题组多年研 究，产用传统诱变方法获得一株菌株，保藏编号CGMCC0890,专利号为：ZL 03112896. 3)中 进行高效表达，并利用此基因工程菌的全细胞作为生物催化剂，以L-精氨酸为底物，实现 了L-鸟氨酸的高效生产。
技术实现思路
本专利技术的主要研究内容：本专利技术利用分子技术克隆了来自Bacilluscereus 的精氨酸酶基因argl，构建重组表达载体pXMJ19-argI，并通过电转化方法将其转化至 C.crenatumSDNN403 中，成功构建了基因工程菌株C.crenatumSDNN403/pXMJ19_argI。酶 活力测定结果发现重组C.crenatumSDNN403工程菌的精氨酸酶活实现从无到有，比酶活达 到24. 3U/mg。基于获得的基因工程菌，对该菌株用于转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸进行了 初步的研究。在8h内，L-鸟氨酸的产量为149. 2g/L，精氨酸摩尔转化率达到99. 5%。 本专利技术采取的技术方案： 精氨酸酶基因工程菌，是将出发菌株Bacilluscereus的精氨酸酶基因连接在表 达载体PXMJ19上，并转化至C.crenatumSDNN403得到重组菌株。以该工程菌为基础，基于 精氨酸酶酶学性质为基础，以L-精氨酸为底物，构建转化化法生产L-鸟氨酸的最佳转化体 系，实现高效生产L-鸟氨酸的方法。 1?精氨酸酶引物设计 根据NCBI中Bacillus cereus全基因组核酸序列中argl基因序列，设计精氨酸 酶基因的PCR引物Pl和P2。 F :5' -ACCCGAAGCTTATGAAAAAAGAAATCTCAGTTATTGG-3' (Hind III) R :5' -ACCGGGATCCTTATTTTAGTTTTTCACCGAATAAAG-3' (BamH I) 2.重组表达载体pXMJ19-argI的构建 参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与 PMD18-Tvector过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选 重组菌，重组质粒经BamHI/hindlll酶切释放出大小为2. 7kb和894bp的基因条带，表明重 组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-argI。 提取保存于E.coliJM109 中的质粒pMD18-T-argI和pXMJ19,质粒pMD18-T-argI 和PXMJ19经BamHI/hindllI双酶切，胶回收纯化，16°C过夜连接，将连接物热击本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型重组表达载体的构建，其特征是以Bacillus cereus基因组DNA为模板，扩增得到精氨酸基因argI，将其克隆到表达载体pXMJ19上，构建重组表达型质粒pXMJ19‑argI。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，王梅洲，徐美娟，张显，杨套伟，
申请(专利权)人：江南大学，江南大学如皋食品生物技术研究所，如皋江大食品生物技术研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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