本发明专利技术公开了一种定点突变的大肠杆菌DNA光修复酶及其构建方法，所述的酶具有SEQ ID NO:1,所述的氨基酸序列。本发明专利技术从现有的WT大肠杆菌中获得DNA光修复酶基因，设计突变引物得到突变的基因片段，连接突变基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒pET22b-A377N；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于突变体酶表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-A377N；在18℃和1mM ITPG条件下获得了较好的表达。表达出的光修复酶活性更加稳定，而且酶的抗氧化效果显著提高。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及一种大肠杆菌光修复酶及其构建方法，特别属于大肠杆菌DNA光修复酶及其构建方法。
技术介绍
：由于人类活动造成的污染与破坏，使得大气中的臭氧层愈发稀薄，阳光里的紫外光强度增加，对人类的伤害越来越大，特别是损伤细胞内部的DNA。紫外光破坏DNA的结构，会阻止DNA的正常复制和转录，会引起皮肤及组织细胞内的信号通路发生改变，造成免疫的抑制，皮肤的炎症，在细胞内积累大量的CPD甚至造成皮肤癌(李沛波，关永源，贺华，丘钦英etal.中波段紫外线对角质形成细胞凋亡的诱导和钙信号的影响[J].中国药理学通报，2004,20(4)：398-402.)。这主要是由于紫外光造成DNA同一条链上的相邻的胸腺嘧啶碱基产生环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutanepyrimidinedimer，CPD)，该光化学产物使DNA结构异常。大肠杆菌DNA光修复酶在可见光作用下，能够裂解还原环丁烷嘧啶二聚体，恢复DNA的正常结构。它是一种典型的环丁烷嘧啶二聚体光修复酶，通过特异性地结合在DNA的嘧啶二聚体上，专一吸收波长300-500nm的近紫外可见光，从而产生活性，将环丁烷嘧啶二聚体还原为两个胸腺嘧啶，这是生物体利用光为驱动力来修复紫外线DNA损伤的重要途径。现有的DNA光修复酶主要用于动物模型和人体实验研究中，显示其在修复基因损伤及阻止基因损伤诱导的生物学效应中具有重要作用，但现有的DNA光修复酶的稳定性比较差，抗氧化能力比较低。
技术实现思路
：本专利技术所解决的技术问第1个技术问题是提供稳定性好的一种定点突变的大肠杆菌DNA光修复酶。本专利技术所要解决的第2个技术问题是上述光修复酶的构建方法。本专利技术所要解决的第3个技术问题是提供上述变体基因编码的光修复酶或包含上述变体基因的表达单元、重组质粒、或宿主细胞。定点突变(site-specificmutagenesis或site-directedmutagenesis)是指通过在目的DNA片段(质粒，基因组)中某些目标位点引入特定的变化(包括碱基的添加，删除，点突变等)。体外定点突变技术是研究蛋白功能与基因之间关系的主要手段，也是实验室里优化基因的常用手段，为改造及优化蛋白质提供了有力的条件。通过聚合酶链式反应(PCR)等方法将某个目的基因的特定碱基突变(碱基缺失或者插入等)，从而改变翻译出来的氨基酸序列，以及随之折叠成的蛋白质的空间结构和发挥的功能，有利于分析蛋白质结构和功能的关系。本专利技术从现有的WT大肠杆菌(Escherichiacoli)中获得DNA光修复酶基因(phr)，设计突变引物得到突变的基因片段，其编码如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，连接突变基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒pET22b-A377N；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于突变体酶表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-A377N；在18℃和1mMITPG条件下获得了较好的表达。表达出的光修复酶活性更加稳定，而且酶的抗氧化效果显著提高。附图说明:图1为phr基因的PCR扩增图M：DL2000；1：phr基因的PCR扩增产物图2为A377N片段PCR扩增图M：DL2000；2:A377N上游片段；3：A377N下游片段；图3为A377N融合PCR扩增图M：DL2000；4：A377N融合PCR产物。图4为实施例1所制的光修复酶纯化的SDS-PAGE电泳图C为菌体总蛋白，P为菌体沉淀，S为破碎上清，E1-E3为纯化蛋白分管收集样品，PM为标准蛋白。图5为实施例1所制的光修复酶(A377N)及WT光修复酶的活性曲线A377N：检测的是第1、3、6、8、12、42天的酶活性变化WT：检测的是第1、3、5、6、11、41天的酶活性变化图6为实施例1所制的光修复酶(A377N)及WT光修复酶的450nm吸收峰变化曲线。A377N：检测的是第1、2、3、4、5、12、42天的450nm吸收峰的变化WT：检测的是1、2、3、4、5、6、11、41天的450nm吸收峰的变化图7为实施例1所制的光修复酶(A377N)及WT光修复酶的580nm吸收峰变化曲线A377N：检测的是第1、2、3、4、5、6、8、12、42天的580nm吸收峰的变化WT：检测的是1、2、3、4、5、6、11、41天的580nm吸收峰的变化具体实施方式:下面结合实施例对本专利技术作详细的说明。实施例1：1、获得WT大肠杆菌光修复酶基因phr通过已知的大肠杆菌(Escherichiacoli)光修复酶(cyclobutanepyrimidinedimerphotolyase,CPDase，EC4.1.99.3)(WT)基因设计引物，以E.coli基因组DNA为模板，经PCR扩增出目的片段(如图1)。phr扩增引物及PCR条件分别为：phrF(NdeI)：5′-CTCCATATGACTACCCATCTGGTCTG-3′phrR(XhoI)：5′-GTGCTCGAGTTTCCCCTTCCGCGCC-3′95℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min循环30次；72℃充分延伸10min。2、构建重组载体pET22b-phr将扩增出的基因片段与质粒pET22b，通过NdeI、XhoI双酶切，在16℃连接20h，转化到E.coliDH5α。筛选出阳性转化子，获得重组质粒pET22b-phr。将双酶切鉴定后，送南京金斯瑞生物公司进行测序，序列比对发现测序基因与Genbank(GeneBankaccessionNO.NC_000913.3)上的完全一致。3、构建突变体菌株设计突变引物，以重组质粒pET22b-phr的DNA为模板进行PCR扩增，扩增出上下游片段(如图2)，将上下游片段融合成目的片段(如图3)。将该片段与pET22b载体连接，构建重组质粒pET22b-A377N，转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，经过Amp抗性筛选阳性克隆，送南京金斯瑞生物公司测序鉴定。A377N突变引物及PCR条件分别为A377AsnL:5′-GGTGATTTGGCAAATAATAAC-3′A377AsnR:5′-TATTATTTGCCAAATCACCA-3′上游扩增片段(含有phr起始密码子的片段)：95℃预变性5min；94℃3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定点突变的大肠杆菌DNA光修复酶，其特征在于：它具有SEQ ID NO:1，所示的氨基酸的序列。
【技术特征摘要】
1.一种定点突变的大肠杆菌DNA光修复酶，其特征在于：它
具有SEQIDNO:1，所示的氨基酸的序列。
2.一种编码权利要求1所述的定点突变大肠杆菌DNA光修复
酶的基因，其特征在于：其含有SEQIDNO:2的核苷酸序列。
3.一种载体，其特征在于：其含有权利要求2所述的核苷酸序
列。
4.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求2所述的基因
或是核苷酸序列，或者含有权利要求3所述的载体。
5.权利要求1所述的一种定点突变的大肠杆菌DNA光修复酶的
构建方法，包...
【专利技术属性】
技术研发人员：文斌，徐蕾，王鹏，朱国萍，田常青，曹正宇，黄士平，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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