一种珠子参转录因子基因PjWRKY1的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种珠子参转录因子基因PjWRKY1的用途，即在提高珠子参皂苷生物合成关键酶基因表达量和增加珠子参愈伤组织中皂苷含量的应用，PjWRKY1基因核苷酸序列如SEQ ID NO︰1所示，编码WRKY类转录因子；本发明专利技术采用功能基因组学和代谢工程相关技术证明珠子参PjWRKY1转录因子具有正调控珠子参皂苷生物合成的功能。将本发明专利技术所述的珠子参PjWRKY1转录因子基因构建到植物表达载体上并转入珠子参愈伤组织中使其过量表达，增强了珠子参皂苷合成途径关键酶基因的表达量，提高了珠子参皂苷的产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学以及基因工程领域，尤其是一种珠子参皂苷生物合成转录因子基因PjWRKY1的应用。
技术介绍
珠子参PanaxjaponicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.WuetK.M.Feng为五加科Araliaceae人参属Panax植物，因根茎节间纤细，节膨大成球形念珠状而得名，其根茎入药。珠子参作为药材，始载于《滇南本草》，为历版《中国药典》收载品种。药用珠子参主产于云南，属名贵常用中药材，是彝族、纳西族、白族、藏族、傈僳族等少数民族的传统用药。目前，野生珠子参主要分布于滇西北、滇东北地区，常见于海拔达2500-4000m的亚高山针叶林及阔叶林下。珠子参性味苦、甘、微寒，归肝、肺、胃经，具有补肺养阴、祛瘀止痛，止血之功效，临床上应用于气阴两虚，烦热口渴，虚痨咳嗽，跌打损伤，关节疼痛，咳血，吐血，外伤出血等。珠子参皂苷(Panaxjaponicussaponins,PJS)为珠子参的主要活性成分，包括达玛烷型、齐墩果烷型三萜皂苷。目前，已从珠子参根茎及叶中分离出了30多种皂苷成分，主要包括竹节参皂苷IVa、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷V、人参皂苷Ro、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1等。人参属的代表物种“人参”(Panaxginseng)主要含达玛烷型皂苷，齐墩果烷型皂苷仅发现含量极微的人参皂苷Ro；另一种人参属著名药材“三七”(Panaxnotoginseng)，只含达玛烷型皂苷，不含齐墩果烷型皂苷。珠子参所含皂苷组分与同属“人参”、“三七”相比，在成分种类以及各组分含量上均存在明显差异，因其含有大量齐墩果烷型皂苷，导致临床上的特殊用途。珠子参为多年生草本植物，需生长6年以上方能入药。目前，珠子参药材多为野生品，无序采挖导致珠子参资源日渐枯竭，生境受到破坏。近些年，以珠子参为组分的药品市场迅速扩大，导致珠子参药材需求增长，供需矛盾突出。鉴于人工栽培时间长，化学合成机理和路线不够清晰等弊端，利用生物工程技术和基因调控的方法来生产珠子参皂苷逐渐成为研究热点。转录因子对基因的转录激活是植物次生代谢过程重要的调控环节。利用转录因子作为改造植物代谢途径的工具，以其独有的“多点调控”优势，弥补了代谢工程操作中单个关键酶基因作用不足和多个关键酶基因可能产生组成性致死表达的情况，成为一种新的策略。次生代谢途径中多个功能相关的酶基因常被同一转录因子正调控或负调控，对转录因子进行基因修饰显然比多基因操作更容易改良目标次生代谢途径。WRKY是植物特有的锌指型转录调控因子，是植物中比较大的转录因子家族，越来越多的研究表明该类转录因子对真核生物的次生代谢过程具有重要调控作用。例如木本棉(Gossypiumarboreum)GaWRKY1转录因子可调节倍半萜烯合酶(+)-δ-杜松烯合酶A的活性；番茄(Solanumlycopersicum)SLWRKY73转录因子能激活其萜类合成酶基因的启动子，促进萜类合成酶基因的表达；西洋参(Panaxquinquefolium)PqWRKY1转录因子可正调控三萜皂苷合成途径关键酶基因的表达。随着对植物次生代谢网络的深入解析和调控机制的阐明，特别是调节特定次生代谢物合成的转录因子的分离和鉴定，基于转录因子的基因工程将为开发利用植物次生代谢物提供更加有效的手段。本专利技术以体外培养的珠子参愈伤组织为研究对象，克隆PjWRKY1转录因子基因，并对该转录因子进行分析和功能鉴定，明确PjWRKY1转录因子在珠子参皂苷生物合成过程中的地位和作用，为获得高效、稳定的珠子参皂苷合成调控技术和同源或异源高效表达系统的建立提供理论参考和依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种珠子参转录因子基因PjWRKY1的用途，即珠子参转录因子基因PjWRKY1在提高珠子参皂苷合成代谢途径中关键酶基因表达量和增加珠子参愈伤组织中皂苷含量的应用；本专利技术从珠子参中克隆获得可调控珠子参皂苷生物合成的转录因子基因PjWRKY1以及明确该转录因子的应用。本专利技术基于同源克隆的原理，从珠子参中克隆得到WRKY类转录因子基因的cDNA并对其编码蛋白进行功能鉴定。专利技术人将这个基因命名为PjWRKY1，基因登录号为KP890786，其中所述cDNA如SEQIDNO︰1所示。对该基因进行序列分析，表明PjWRKY1cDNA大小为820bp，具有807bp的开放阅读框(Openreadingframe，ORF)，编码含有268个氨基酸的蛋白质，氨基酸序列如SEQIDNO︰2所示。利用植物表达载体，通过农杆菌介导法将本专利技术的PjWRKY1转录因子基因导入珠子参愈伤组织中，可提高珠子参皂苷合成途径关键酶基因的表达量，使珠子参皂苷的产量增加。上述转录因子基因可应用于正调控珠子参皂苷的生物合成，具体操作如下：（1）基因的获得：提取珠子参总RNA，反转录合成cDNA第一链。通过RT-PCR扩增出PjWRKY1的全长编码区，然后将其连接到pGEM-Teasy载体上，经测序验证获得具有目的基因的克隆。（2）植物表达载体构建与遗传转化：用限制性内切酶BamHI和XbaI酶切pGEM-T-PjWRKY1质粒，通过胶回收获得目的基因片段。用同样的内切酶消化植物表达载体pCAMBIA2300S，胶回收获得载体大片段。将目的基因片段与pCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体pCAMBIA2300S-PjWRKY1。通过液氮冻融法将pCAMBIA2300S-PjWRKY1质粒导入农杆菌菌株EHA105中。利用农杆菌介导的遗传转化法，将PjWRKY1导入珠子参愈伤组织中使其过量表达。通过抗生素筛选和qRT-PCR筛选阳性转基因细胞系。（3）转基因细胞系皂苷含量检测：提取珠子参转基因和非转基因细胞系中的皂苷，分析转基因和非转基因细胞系间皂苷含量的差异。本专利技术为提高珠子参中皂苷的含量提供了一种新方法，利用生物工程技术和基因调控的方法可更高效率合成珠子参皂苷，克服了人工栽培周期长、化学合成机理和路线不够清晰等缺点。将转录因子PjWRKY1基因导入珠子参细胞中表达，使珠子参皂苷生物合成途径关键酶基因的表达量提高，增加了珠子参皂苷的产量，为大规模产业化生产珠子参皂苷提供了理论参考和科学依据。附图说明图1为本专利技术中珠子参总RNA电泳图谱；图2为本专利技术中PjWRKY1RT-PCR检测结果。其中M为DL2000DNAMarker，1为PjWRKY1的RT-PCR产物；图3为本专利技术中PjWRKY1的三维结构预测；图4为本专利技术中qRT-PCR结果分析图，表示珠子参皂苷合成途径中受PjWRKY1调控的FPS和SS基因在野生型和转基因细胞系中的表达水平，其中C为野生型细胞系，1-3为转基因细胞系；图5为本专利技术中珠子参中皂苷含量测定结果，其中C为野生型细胞系，1-3为转基因细胞系。具体实施方式下面通过附图和实施例对本专利技术进一步说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种珠子参转录因子基因PjWRKY1在提高珠子参皂苷合成代谢途径中关键酶基因表达量和增加珠子参愈伤组织中皂苷含量的应用，其特征在于：所述珠子参转录因子基因PjWRKY1的核苷酸序列如SEQ ID NO︰1 所示。

【技术特征摘要】
1.一种珠子参转录因子基因PjWRKY1在提高珠子参皂苷合成代谢途径中关键酶基因表达量和增加珠子参愈伤组织中皂苷含量的应用，其特征在于：所述珠子参转录因子基因PjWRKY1的核苷酸序列如SEQIDNO︰1所示。
2.根据权利要求1所述的珠子参转录因子基因PjWRKY1应用，其特征在于具体操作如下：
（1）将珠子参转录因子基因PjWRKY1与植物超表达载体pCAMBIA...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛锋，黄壮嘉，刘迪秋，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53