一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法，包括以下步骤：(1)构建含有3个Nrf2结合位点的报告基因；(2)将报告基因插入到质粒当中，得到报告基因质粒；(3)用大肠杆菌将报告基因质粒扩增并提纯质粒；(4)用提纯的报告基因质粒转染HeLa细胞，筛选稳定表达细胞株用于未知化合物的筛选。本发明专利技术使现有技术中的检测Nrf2激活作用的方法能够适应新药前期开发阶段高通量筛选的需求。原有方法完成一次检测通常需要半天到两天不等，而一次实验所能检测的样品数量不超过十几个。本发明专利技术的方法，每个96孔板可检测至少10个样品，完成一个96孔板检测的时间少于30分钟。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法。
技术介绍
Nrf2蛋白是细胞内的一种转录因子，控制基因的表达。Nrf2在细胞受到外界有害刺激后被激活，激活的Nrf2增加多种细胞内保护因子的基因表达水平，产生细胞保护效应，抑制细胞的损伤。利用小分子化合物(药物)作为Nrf2的激活剂，在没有外界有害刺激的情况下通过药物作用激活Nrf2，起到细胞保护作用，是目前新药研发的一个方向。目前国外开发的小分子Nrf2激活剂有些已经进入临床研究阶段。在新药开发的前期阶段，需要从众多的化合物中筛选具有Nrf2激活作用的化合物。目前常用的研究方法包括：(1)用分子生物学方法检测Nrf2靶基因的表达水平(如：TanKP,YangM,ItoS:Activationofnuclearfactor(erythroid-2like)factor2bytoxicbileacidsprovokesadaptivedefenseresponsestoenhancecellsurvivalattheemergenceofoxidativestress.MolPharmacol2007,72(5):1380-1390.)。主要缺点：实验步骤复杂，无法满足高通量(高效率)筛选的需要；结果随机误差大。(2)用生物化学方法检测Nrf2靶基因(主要是NAD(P)H:醌氧化还原酶-1)的功能活性(如：Dinkova-KostovaAT,LibyKT,StephensonKK,HoltzclawWD,GaoX,SuhN,WilliamsC,RisingsongR,HondaT,GribbleGWetal:Extremelypotenttriterpenoidinducersofthephase2response:correlationsofprotectionagainstoxidantandinflammatorystress.ProcNatlAcadSciUSA2005,102(12):4584-4589.)。主要缺点：实验结果不能直接反映Nrf2的功能活性，特异性较差；较难实现高通量筛选。(3)用生物化学的方法检测Nrf2蛋白在细胞中的积累水平(如：WondrakGT,CabelloCM,VilleneuveNF,ZhangS,LeyS,LiY,SunZ,ZhangDD:Cinnamoyl-basedNrf2-activatorstargetinghumanskincellphoto-oxidativestress.FreeRadicBiolMed2008,45(4):385-395.)。主要缺点：无法满足高通量筛选的需要。(4)在细胞中瞬时表达带有Nrf2结合位点的报告基因，检测Nrf2增强基因表达的功能水平(WondrakGT,CabelloCM,VilleneuveNF,ZhangS,LeyS,LiY,SunZ,ZhangDD:Cinnamoyl-basedNrf2-activatorstargetinghumanskincellphoto-oxidativestress.FreeRadicBiolMed2008,45(4):385-395.)。此方法与其他方法相比主要的优点是检测数据能够直接反映Nrf2的转录因子功能活性。主要缺点：无法满足高通量筛选的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法，步骤如下：(1)构建含有3个Nrf2结合位点的报告基因；(2)将报告基因插入到pGL4.26[luc2/minP/Hygro]质粒当中，得到报告基因质粒；(3)用大肠杆菌(或感受态DH5α菌株)将报告基因质粒扩增并提纯质粒；(4)用提纯的报告基因质粒转染HeLa细胞。稳定转染后是否能得到反应性良好的细胞株取决于所用的报告基因DNA序列，所用的质粒系统和所用的细胞之间的组合效果，最终的结果无法预测，只能通过实验确定最终产品是否可用。本专利技术用pGL4.26[luc2/minP/Hygro]质粒和HeLa细胞搭配制备得到的稳定表达细胞株，经过用已知的Nrf2激活物刺激细胞和用Nrf2基因沉默(抑制原有Nrf2的活性)正反两种方法，均证实具有能满足试验需要的敏感性和特异性。所述步骤(4)中还包括用已知的Nrf2激活剂鉴定各细胞株的反应性，选取反应性良好(即：药物Sulforaphane或Tert-butylhydroquinone诱导的Luciferase活性与对照(相应浓度的药物溶剂，如DMSO)处理相比增加2倍以上)的细胞株。上述的方法在新药研发中的应用。上述的方法筛选得到的化合物，所述的化合物在制备具有Nrf2激活活性药物中的应用本专利技术的有益效果：高通量是制药企业研发所需要的，稳定转染后是否能得到反应性良好的细胞株取决于所用的报告基因DNA序列和所用的细胞之间的组合效果，最终结果无法预测，只能通过实验摸索，这是成功与否的难点之一。本专利技术改进了原有的检测Nrf2激活作用的方法，使其能够适应新药前期开发阶段高通量筛选的需求。原有方法完成一次检测通常需要半天到两天不等，而一次实验所能检测的样品数量不超过十几个。使用本专利技术的方法，每个96孔板可检测至少10个样品，完成一个96孔板检测的时间少于30分钟。本专利技术采用新一代的含抗生素抗性基因的质粒系统，不但克服了无法进行稳定转染的缺陷，而且新一代质粒在报告基因末端增加了转录增强子元件，更加优化了在哺乳动物细胞中表达的敏感性和特异性。高通量检测技术是以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在短时间内检测数以千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的技术体系，它具有微量、快速、灵敏和准确等特点，是当今制药企业在新药研发初始阶段必不可少的工具。针对不同的生物分子靶点或不同类别的化合物，必须有现成的分子水平和细胞水平的实验方法才能完成筛选工作，我们的方法即是建立了针对“Nrf2”的分子水平和细胞水平的实验方法，是针对Nrf2为生物靶点的新药研制高通量筛选流程的基础。附图说明图1为本专利技术流程图；图2为HygromycinB筛选后光镜下见到的稳定表达细胞克隆的形态。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术作进一步说明。如图1所示，一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法，其特征是，步骤如下：(1)构建含有3个Nrf2结合位点的报告基因；(2)将报告基因插入到质粒当中，得到报告基因质粒；(3)用大肠杆菌将报告基因质粒扩增并提纯质粒；(4)用提纯的报告基因质粒转染HeLa细胞，筛选稳定表达细胞株用于未知化合物的筛选。

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法，其特征是，步骤如下：
(1)构建含有3个Nrf2结合位点的报告基因；
(2)将报告基因插入到质粒当中，得到报告基因质粒；
(3)用大肠杆菌将报告基因质粒扩增并提纯质粒；
(4)用提纯的报告基因质粒转染HeLa细胞，筛选稳定表达细胞株用于未知化合物的筛
选。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)具体如下：
(1)合成单链DNA片段I，序列如SEQIDNo.1和单链DNA片段II，序列如SEQIDNo.2，
(2)将片段I和片段II分别溶解在超纯净水中配成100μM浓度的溶液；
(3)将两种溶液等量混合，加热至95℃，然后冷却至室温，产物即为报告基因。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述步骤(3)中以1℃/mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋凡，叶青，仵霄，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37