一种动物转基因标签的可视化检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种动物转基因标签的可视化检测方法。本发明专利技术设计、筛选出转基因猪标记基因(Neo)LAMP特异性引物，并优化LAMP反应体系中Mg2+、Betaine、dNTPs、Bst DNA polymerase的浓度以及外引物内引物浓度比，确定了LAMP反应的最适反应条件。建立了可视化LAMP检测方法，可在65℃恒温条件下对不同浓度的转基因猪基因组进行检测，LAMP法检测的灵敏度为2pg/μl，而PCR法仅能检测至2ng/μl。LAMP法检测转基因猪样本准确性达98％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种动物转基因标签的可视化检测方法。
技术介绍
转基因动物就是指通过人工的方法将特定的目的基因导入动物体内，使之有效整合到基因组，并能遗传给下一代的动物。1981年，美国学者将大鼠生长激素重组基因导入小鼠受精卵中，第一只转基因动物“超级鼠”诞生了。克隆羊“多利”的出现，使转基因动物技术和克隆技术取得了前所未有的进展，此后相继出现了各种转基因动物，如转基因兔、猪、鱼、牛、鸡等。学者们对转基因动物的研究大致分成四个方向：疾病动物模型的建立、转基因动物制药、对传统动物性状的改良和基础生物学研究。目前转基因动物及其产品已经渗透到医疗、卫生、农产品和食品等各个领域，具有广泛的应用前景。转基因技术与传统育种技术的本质上都属于遗传改良。不同的是，传统的动物育种是染色体之间转移，是经过漫长的自然选择和相近物种的杂交产生的。相比之下，转基因动物则是在实验室进行构建的，有目的性地对特定基因进行转移，可人为地加快物种的改良速度。但目前公众对转基因生物及其产品的安全性存在质疑。为此，各国政府对转基因动物的安全评价特别慎重，已经颁布了相应的管理法则。我国国务院也于2001年颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，成立了转基因动物评价安全委员会等相关组织，并严格制定了转基因生物安全评价的标准和框架体系，严格监督和规范了我国转基因动物及其产品的研究和应用。在大多数转基因动物的制备过程，需要转入目的基因的同时将抗性基因整合入体细胞、胚胎干细胞等，再通过筛选药物对细胞进行筛选，从而得到整合有目的基因的转染细胞。筛选标记通常来自于细菌和病毒的耐药基因或毒力基因：新霉素磷酸转移酶(neo)、嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)、潮霉素B磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、次黄嘌呤磷酸转移酶(Hprt)、白喉毒素(DT)、胸腺嘧啶激酶(tk)等。新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase,neo)，是一种编码氨基糖苷磷酸核糖转移酶的基因，成功整合neo的转染细胞具有G418抗性，是最常用的抗性基因。抗性基因同样是由4种碱基组合而成，其本身并无直接毒性，不会对人类或其他生物产生危害，但其表达产物可能会对受体动物造成多方面效应，如毒性效应、过敏效应、因蛋白的催化功能而产生的副作用，或产生对人类及其他生物体有害的物质。因此，转基因动物中抗性基因的检测在生物安全性评价中至关重要。外源基因及其表达产物检测方法主要包括PCR、Southernblot、基因芯片、ELISA、Westernblot和蛋白质芯片等，但这些方法需要比较严格的技术要求和相对昂贵的设备仪器或试剂，并不适用于基层单位的检测和在现场的快速检测。环介导等温扩增技术(LAMP)是日本荣研化学株式会社的NotomiT团队于2000年开发的一种新型核酸扩增方法。LAMP法特异性强、灵敏度高、简单省时，对操作人员不需要进行严格的专业培训，且不需要昂贵的检测仪器，适用于基层单位的检测，满足现场的快速检测的要求，具有非常广泛的应用前景。但是，目前的扩增方法的特异性、灵敏度不高，因此，提供一种特异性好、灵敏度高的扩增方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种动物转基因标签的可视化检测方法。该引物组特异性高。该LAMP反应体系，使反应在50-60min范围内即可完成；对转基因猪Neo基因进行LAMP和PCR两种方法的检测，其中LAMP法灵敏度达到2pg/μl，比PCR法高出3个数量级；分别用LAMP法和PCR法检测50个转基因猪样本，测得结果一致性为98％。本研究的结果可为转基因动物抗性基因的检测提供了新方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种引物组，包括具有如SEQIDNo.1～SEQIDNo.4所示序列的核苷酸。LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc区以及5’端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。FIP(ForwardInnerPrimer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。在本专利技术中，FIP引物具有如SEQIDNo.3所示序列。F3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。在本专利技术中，F3引物具有如SEQIDNo.1所示序列。BIP引物：下游内部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。在本专利技术中，BIP引物具有如SEQIDNo.4所示序列。B3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。在本专利技术中，B3引物具有如SEQIDNo.2所示序列。本专利技术还提供了所述的引物组在用于扩增转基因动物的抗性基因中的应用。在本专利技术的一些实施例中，所述基因为转基因猪的Neo基因。在本专利技术的一些实施例中，所述扩增为环介导等温扩增。本专利技术还提供了一种试剂盒，包括所述的引物组。在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术提供的试剂盒还包括Mg2+，所述Mg2+的浓度为5mmol/L～11mmol/L。在本专利技术的一些实施例中，所述Mg2+的浓度为7mmol/L。在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术提供的试剂盒还包括甜菜碱，所述甜菜碱的浓度为0mol/L～0.8mol/L。在本专利技术的一些实施例中，所述甜菜碱的浓度为0.6mol/L。在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术提供的试剂盒还包括dNTPs，所述dNTPs的浓度为1.0mol/L～1.8mol/L。在本专利技术的一些实施例中，所述dNTPs的浓度为1.4mmol/L。在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术提供的试剂盒所述外引物与内引物的浓度比为1:4～1:10。在本专利技术的一些实施例中，所述外引物与内引物的浓度比为1:8。在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术提供的试剂盒还包括BstDNA聚合酶，所述BstDNA聚合酶的添加量为6.4～9.6U。在本专利技术的一些实施例中，所述BstDNA聚合酶的添加量为8U。本专利技术还提供了所述的试剂盒在用于扩增转基因动物的抗性基因中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术提供的应用中，所述试剂盒用于环介导等温扩增转基因猪的Neo基因。本专利技术还提供了一种检测转移基因动物的抗性基因的方法，利用所述的引物组或所述的试剂盒进行扩增。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法中扩增为环介导等温扩增。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法中所述转基因动物为转基因猪。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述方法中所述抗性基因为Neo基因。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物组，其特征在于，包括具有如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示序列的核苷酸。

【技术特征摘要】
1.一种引物组，其特征在于，包括具有如SEQIDNo.1～SEQIDNo.4所示序列的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的引物组在用于扩增转基因动物的抗性基因中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Mg2+，所述Mg2+的浓度为5mmol/L～11mmol/L。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，还包括甜菜碱，所述甜菜碱的浓度为0mol/L～0.8mol/L。
6.根据权利要求3至5任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括dN...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦虎平，逄大欣，欧阳红生，孙鑫，谢子聪，王侃侃，郭南南，李家宁，李梦静，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22