本发明专利技术涉及一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物及方法，步骤如下：(1)提取植株的总RNA；(2)以植株的总RNA为模板进行反转录合成cDNA；(3)以cDNA为模板对ToCV和TYLCV衣壳蛋白编码的核酸序列进行PCR扩增；(4)对步骤(3)制得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明专利技术涉及上述PCR引物组合，利用双重PCR方法来进行ToCV与TYLCV的鉴定，结果准确、方法快速简便，节约检测成本，大大提高了病毒检测效率，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物及方法，属于农业生物
技术介绍
番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)和番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)是番茄上的两种重要病毒，给番茄生产造成严重威胁。TYLCV属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的DNA病毒，染病番茄植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片常稍褪绿发黄、变小，叶片边缘上卷，叶片增厚，叶质变硬，是当前保护地番茄首要病害。而ToCV属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)的RNA病毒，染病番茄叶片褪绿黄化，叶脉深绿，感病叶片变脆且易折，叶片黄化疑似营养缺素症，近年来成为我国番茄生产中的又一重要病害。随着两种病毒在田间的暴发为害，在我国山东、河北、北京等地发现大量ToCV和TYLCV(ToCV&TYLCV)共同侵染的番茄植株，较单种病毒单独为害情况，两种病毒共同侵染植株的发病症状更加明显，加速了病毒植株的死亡速度。随着TYLCV与ToCV的发生流行及其给番茄生产带来的重大经济损失，实现快速灵敏的分析鉴定，是预防与控制病毒病的首要选择。因此，开发快速准确、简便经济的可以同时检测TYLCV与ToCV两种病毒的方法，是一项重要而紧迫的任务。传统的TYLCV的检测方法：抽取病株DNA，以DNA模板，利用TYLCV的特异引物进行常规PCR检测(周涛，师迎春，陈笑瑜等，2010.北京地区番茄黄化曲叶病毒病的鉴定及防治对策.植物保护，36(2):116-118.)。传统ToCV的检测方法：抽取病毒RNA，将RNA反转录成cDNA，再以cDNA模板，利用ToCV的特异引物进行常规PCR检测(赵黎明，李刚，刘永光等，2014.番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定.中国蔬菜，12：15-20；赵汝娜，王蓉，师迎春等，2014.侵染甜椒的番茄褪绿病毒的分子鉴定.植物保护，40(1)：128-130.)。利用上述传统方法检测TYLCV或ToCV侵染的植株，操作步骤繁琐且耗时。多重PCR(multiplexPCR)技术又称多重引物PCR或复合PCR技术，是常规PCR技术的基础上改进和发展起来的一种新型的PCR扩增技术，是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个不同的DNA片段。本专利利用多重PCR技术，针对TYLCV和ToCV衣壳蛋白的核酸序列设计扩增TYLCV和ToCV双重PCR特异引物，仅需样品的cDNA作为模板，便可在同一PCR体系中快速鉴别TYLCV和ToCV两种病毒，尤其对TYLCV和ToCV混合感染的植株更为实用。这种方法既保留了常规PCR方法的特异性、敏感性，又减少了操作步骤及试剂用量，大大提高了检测的效率，节省了检测的人力、物力和财力，在田间TYLCV或ToCV病毒的监测上具有独特的优势和极高的使用价值。目前利用双重PCR技术构建快速鉴别ToCV和TYLCV的方法未见报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物及方法。一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物，所述引物为2对，分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的核苷酸序列与SEQIDNO.3、SEQIDNO.4与所示的核苷酸序列。正义引物ToCV-F：5’-GGTCAATTATGAGGTCGTGAA-3’；SEQIDNO.1反义引物ToCV-R：5’-CTCTGCCCAGACTTGTAATCA-3’；SEQIDNO.2正义引物TYLCV-F：5’-ACTTCGACAGCCCATACAGC-3’；SEQIDNO.3反义引物TYLCV-R：5’-GAAACCTATCCCGCAAATCA-3’；SEQIDNO.4一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的方法，步骤如下：(1)提取待测样品的RNA，制得RNA溶液；(2)以步骤(1)制得的RNA为模板，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA；(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板，利用上述的2对引物对cDNA进行双重PCR扩增，制得双重PCR扩增产物；(4)对步骤(3)制得的双重PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当双重PCR产物电泳图谱显示被测样品有231bp和471bp两条条带出现时，则该被检测样品为番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的植株；当电泳图谱显示被测样品有471bp的一条条带时，则该被检测样品为番茄黄化曲叶病毒侵染的植株；当电泳图谱显示被测样品有231bp的一条条带时，则该被检测样品为番茄褪绿病毒侵染的植株。优选的，所述步骤(3)中20μLPCR扩增的体系(TaKaRa)为：模板2.0μL；浓度为2.5mM的dNTP2.0μL；10×Taqbuffer2.0μL；rTaq0.3μL；浓度为10μM的引物各0.3μL；ddH2O补至20μL。优选的，所述步骤(3)中PCR扩增的程序如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。上述步骤(1)中提取病毒植株总RNA、步骤(2)中RNA反转录为cDNA和步骤(4)中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)。有益效果1、本专利技术所述鉴别ToCV与TYLCV的双重PCR引物均针对病毒衣壳蛋白的核酸序列设计，特异性高，在同一个PCR反应体系中，仅需要样品的cDNA模板便可同时扩增模板中ToCV与TYLCV基因，此方法减少了操作步骤及试剂用量，降低了检测成本，大大提高了两种病毒检测效率。2、本专利技术从分子水平探索了快速检测ToCV与TYLCV两种病毒的方法，探索建立了同时检测ToCV与TYLCV两种病毒的双重PCR技术，为今后ToCV与TYLCV的动态鉴定、发生预警及综合防治奠定了基础。附图说明图1是实施例1中双重PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图中M：2000bpDNALadder；1：健康植株；2：阳性对照；3：TYLCV与ToCV复合侵染植株；4：ToCV植株；5：TYLCV植株。图2是实施例2中双重PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图中M：2000bpDNALadder；1：健康植株；2：ToCV与TYLCV复本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物，其特征在于，所述引物为2对，分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的双重PCR引物，其特征在于，所述引
物为2对，分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的核苷酸序列与SEQIDNO.3、SEQID
NO.4所示的核苷酸序列。
2.一种鉴别番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取待测样品的RNA，制得RNA溶液；
(2)以步骤(1)制得的RNA为模板，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA；
(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板，利用上述的2对引物对cDNA进行双重PCR
扩增，制得双重PCR扩增产物；
(4)对步骤(3)制得的双重PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当双重PCR产
物电泳图谱显示被测样品有231bp和471bp两条条带出现时，则该被检测样品为鉴别...
【专利技术属性】
技术研发人员：李洁，孙珊，褚栋，丁天波，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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