一种促红细胞生成素模拟肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种能够长效促红细胞生成的促红细胞生成素模拟肽及其可药用盐。本发明专利技术还提供了上述促红细胞生成素模拟肽在用于治疗红细胞缺乏或红细胞生成素缺乏或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。其中，本发明专利技术提供的促红细胞生成素模拟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：GGLYAX1GHMGPIX2VX3GQPLRX4K；其中，X1、X3为烯丙基甘氨酸，X2为3-(1-萘基)-L-丙氨酸，X3为肌氨酸所述烯丙基氨酸之间通过烯烃复分解反应形成烯烃键，N末端乙酰化。本发明专利技术的促红细胞生成素模拟肽能够促进红细胞的生成，同进还显著延长了药物在体内的半衰期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，涉及一种促红细胞生成素模拟肽，具体地说，本专利技术涉及一种能够和促红细胞生成素受体结合并激活促红细胞生成素受体或者能起促红细胞生成素激动作用的促红细胞生成素模拟肽及其制备方法，本专利技术还涉及所述模拟肽在制备治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。
技术介绍
促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白激素，分子量约34kD。血浆中存在的促红细胞生成素由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖的成分主要是唾液酸。根据碳水化合物含量不同，天然存在的促红细胞生成素分为两种类型即α型和β型，其中，α型含34％的碳水化合物，β型含26％的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类促红细胞生成素基因位于7号染色体长22区，1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成素(recombinanthumanerythropoietin,rHuEPO)，广泛用于临床。应用重组DNA技术已经生物合成出促红细胞生成素(Egrie，JC，Strickland,TW，Lane，J等(986)免疫生物学(Immunobiol)72:213-224)，该方法是通过插入到中国仓鼠的卵巢组织细胞(CHO细胞)中并且表达的克隆的人促红细胞生成素基因得到产物。天然存在的人促红细胞生成素首先翻译成含有166个氨基酸并且166位是精氨酸的多肽链。在翻译后修饰中，用羟肽酶裂解掉166位精氨酸。没有糖基的人EP0的多肽链的分子量是18236Da，在完整的促红细胞生成素分子中，糖基占整个分子量的大约40％(J.Biol.Chem.262:12059)。促红细胞生成素是最早应用于临床的细胞因子，是迄今所知作用最单一、且安全可靠的升血红蛋白制剂。对于肾贫血、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及阵发性夜间血尿等均有一定疗效；此外，应用促红细胞生成素还可减少手术中的输血量，并能在一定程度上纠正由恶性肿瘤、化疗及类风湿性关节炎引起的贫血。由于促红细胞生成素主要由肾小管内皮细胞产生，肾性疾患引起的贫血是促红细胞生成素的首选适应证；促红细胞生成素纠正肾性贫血的疗效几乎是100％，但并不能改善肾功能。促红细胞生成素的治疗安全、有效，适合长期治疗，也能避免血源紧张。在2006年的全球生物技术药市场上，促红细胞生成素类的重组药物占119亿美元，具有巨大的市场容量。早在1989年，美国FDA就正式批准重组人促红素(EPOGEN)用于肾性贫血的治疗，但直到1992年才在我国上市。我国慢性肾炎的年发病率约为0.25％，其中相当一部分患者最终会转为肾衰，每年的肾性贫血患者约50-60万。根据保守的用药量估算，如果按当前的价格30-40元/支，加上癌症相关性贫血等其他病人的用药，国内市场容量约12-16亿元甚至更大(病人平均体重按50Kg计算)。自20世纪90年代后期，促红细胞生成素已进入我国重点城市医院畅销药品行列，2003年在全国重点城市样本医院用药金额6213万元，排名第56位。2004年，全国重点城市样本医院购药金额增长到8049万元，同比增长了30％。促红细胞生成素作为一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终成熟的内分泌激素，对机体供氧状况发挥重要的调控作用。在胚胎早期，促红细胞生成素由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。在促红细胞生成素诱导红组细胞分化过程中，球蛋白被诱导，这能使细胞吸收更多的铁合成功能性的血红蛋白，这种功能性的血红蛋白可以和成熟的红血球中的氧结合，因此，红血球和血红蛋白在提供机体氧方面扮演了极其重要的角色。这一过程是由促红细胞生成素与红组细胞的表面受体之间的相互作用引起的。当人体处于健康状态时，组织可以从已经存在的红血球中吸收足够多的氧，此时体内的促红细胞生成素浓度很低，这种正常的较低的促红细胞生成素浓度完全可以剌激促进由于年龄的问题而正常损失的红细胞。当循环系统中的依靠红细胞进行氧输送的水平被降低进而出现缺氧情况时，促红细胞生成素在体内的数量将会增加，机体缺氧状态可以由以下原因引起的：过量的辐射、因高纬度或长期昏迷造成的氧摄入量减少、各种类型的贫血等等。作为对组织处于缺氧压力的应答，促红细胞生成素水平的提高可以刺激红组细胞的分化达到提高红细胞生成的能力。当体内的红细胞的数量大于正常组织的需求时，循环系统中促红细胞生成素的水平被降低。正是由于促红细胞生成素对于红细胞的生成有着至关重要的作用，因此这类激素对于治疗和诊断以红细胞生成低下和缺陷为特征的血液病方面有着很广泛的前景。最近的研究为推测促红细胞生成素疗法在多种疾病、紊乱和血液学异常情况中的效用提供了基础，这些疾病包括：慢性肾衰竭(CRF)患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素和在艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素(Danna,RP，Rudnick，SA，Abels，RI，于：MB，Garnick编著，临床应用中的促红细胞生成素一国际展望(ErythropoietininClinicalApplications-AnInternationalPerspective.MarcelDekker；1990:p301-324)。促红细胞生成素的部分生物学效应可以通过和细胞膜表面的受体的内在作用来调节。起先，使用从小鼠的脾脏里分离出的未成熟的红细胞来研究细胞表面结合的促红细胞生成素蛋白时发现，这种蛋白是由两种多聚肽组成，其分子量大约为85000～100000KD(Sawyer,etal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3690-3694)由比较详细的叙述。促红细胞生成素的结合位点的数目也被计算出来了，大约每个细胞膜含有800～1000个位点。在这些结合位点中大约有300个结合位点的Kd水平为90pM，而剩下的结合位点的结合力比较弱，大约有570pM。有研究表明从感染了friend病毒贫血株的小鼠的脾脏红细胞对EP0的响应情况发现，大约有400个结合位点，其中Kd水平高的为100pM，Kd水平低的为800pM。随后的工作就是两种促红细胞生成素受体被单个基因翻录，这个基因已经被克隆。例如，小鼠和人的促红细胞生成素受体的DNA序列以及编码肽的序列在WO90/08822中已经有叙述。目前的模型表明促红细胞生成素结合到促红细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促红细胞生成素模拟肽，其特征在于，所述模拟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示:SEQ ID NO:1GGLYAX1GHMGPIX2VX3GQPLRX4K；其中，X1、X3为烯丙基甘氨酸(D‑Allyiglycin)，X2为3‑(1‑萘基)‑L‑丙氨酸(Nal)，X4为肌氨酸(Sar)所述烯丙基氨酸之间通过烯烃复分解反应形成烯烃键，N末端乙酰化。

【技术特征摘要】
1.一种促红细胞生成素模拟肽，其特征在于，所述模拟肽的氨基酸序
列如SEQIDNO:1所示:
SEQIDNO:1GGLYAX1GHMGPIX2VX3GQPLRX4K；
其中，X1、X3为烯丙基甘氨酸(D-Allyiglycin)，X2为3-(1-萘基)-L-
丙氨酸(Nal)，X4为肌氨酸(Sar)所述烯丙基氨酸之间通过烯烃复分解反
应形成烯烃键，N末端乙酰化。
2.如权利要求1所述的模拟肽的制备方法，其特征在于，所述制备方
法包括：
1)根据SEQIDNO:1选择氨基酸；
2)通过Fmoc固相多肽合成法合成序列如SEQIDNO:1所示的模拟肽；
3)将步骤2)得到的模拟肽溶解于二氯甲烷并在格拉布催化剂催化作用
下通过烯烃复分解反应形成烯烃键；
优选地，所述制备方法还包括：4)将步骤2)得到的模拟肽进行纯化，
经脱盐及冷冻干燥后得到模拟肽干粉；更优选地，所述纯化是通过HPLCC18
半制备柱，以乙腈为流动相实现的。
3.一种促红细胞生成素模拟肽的可药用盐，其特征在于，所述可药用
盐由权利要求1所述的模拟肽与酸性化合物或碱性化合物反应形成；
优选地，所述可药用盐选自硫酸盐、焦硫酸盐、三氟乙酸盐、亚硫酸
盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、
盐酸盐、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、
异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、
辛二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-l,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯
甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、
甲氧基苯甲酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、
γ-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-l-磺酸盐、
萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐中的一种或多种，进一步优选为三氟乙酸盐。
4.如权利要求3所述的可药用盐，其特征在于，所述所述酸性化合物

\t选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、
...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚珉，夏广萍，王士伟，郑学敏，赵娜夏，魏群超，韩英梅，周植星，
申请(专利权)人：天津药物研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12