干细胞无血清培养基及干细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种干细胞无血清培养基，包括基础培养基，胰岛素、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、孕酮和丁二胺。同时，本发明专利技术还公开了一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：获取干细胞，采用本发明专利技术提供的干细胞无血清培养基进行体外培养。通过本发明专利技术提供的干细胞无血清培养基所获得的细胞，不仅可避免血清培养基所携带的病原体污染造成纯化细胞困难的问题，而且能够提高细胞生产的稳定性、提高细胞增殖量，以及增强细胞活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程
，特别涉及干细胞无血清培养基及干细胞的培养方法。
技术介绍
目前，在干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用的是胎牛血清或新生小牛血清。血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用。但它也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞毒性作用。血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞培养表达产品分离纯化带来很大的困难。而且动物血清可能存在动物携带的已知或未知病原体，对以后可能的临床应用构成威胁，对用于规模化培养细胞增加了难度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术中利用动物血清培养干细胞存在一定的毒性作用及病原体污染等缺陷，提供一种无毒性且无污染的干细胞无血清培养基。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种干细胞无血清培养基，包括基础培养基，还包括胰岛素、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂、和亚硒酸钠、孕酮和丁二胺。在本专利技术提供的干细胞无血清培养基中，所述含铁的食品添加剂包括转铁蛋白、柠檬酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中一种或多种。在本专利技术提供的干细胞无血清培养基中，所述干细胞无血清培养基中，胰岛素的浓度为1-15μg/ml、谷氨酰胺的浓度为1-5mmol/l、含铁的食品添加剂的浓度为20-200ng/ml、亚硒酸钠的浓度为20-50nmol/l、孕酮的浓度为5-30mmol/l和丁二胺的浓度为10-100μmol/l。在本专利技术提供的干细胞无血清培养基中，还包括还包括HEPES和青霉素。在本专利技术提供的干细胞无血清培养基中，所述HEPES的浓度为2-20mmol/l，青霉素的浓度为10-100mg/ml。在本专利技术提供的干细胞无血清培养基中，还包括葡萄糖、NaHCO3、大豆胰酶抑制剂、亚油酸和链霉素。在本专利技术提供的干细胞无血清培养基中，所述葡萄糖的质量分数为0.1-1％，NaHCO3的浓度为1-10mmol/l，大豆胰酶抑制剂的质量分数为0.05-0.2％，亚油酸的浓度为10-100μmol/l，链霉素的浓度为10-100mg/ml。在本专利技术提供的干细胞无血清培养基中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。本专利技术进一步提供一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：获取干细胞，采用上述的干细胞无血清培养基进行体外培养。实施本专利技术提供的干细胞无血清培养基及干细胞的培养方法，可以达到以下有益效果：1、采用干细胞无血清培养基能够避免现有技术中血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性；2、可避免现有技术存在血清所带来的外源性污染及血清组分的细胞毒性作用；3、能够避免不明的血清组分对细胞培养及试验研究的影响；4、成份相对明确、质量一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化；5、能够延长细胞的GI期或迫使细胞处于G0期而较长时间的维持细胞高密度培养，从而尽可能的生产目的产物，并更好地保持干细胞的特性。具体实施方式为解决现有技术中采用含有动物血清的培养基培养干细胞血清组分存在易产生毒性作用，并携带有病原体且细胞分离纯化困难等缺陷，本专利技术的创新点在于提供一种干细胞无血清培养基，通过在培养基中加入能够替代血清的补充因子，从而实现了无污染培养干细胞，提高细胞产品生产稳定性的目的。本专利技术提供的干细胞无血清培养基，包括基础培养基、胰岛素、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、孕酮和丁二胺。其中，基础培养基中的葡萄糖是细胞生长增殖以及产物表达过程中的重要能量来源，优选地，基础培养基为DMEM/F12培养基，该DMEM/F12培养基中含有极其丰富和复杂的细胞生长所需的营养物质，能够支持多种类型细胞在无血清的培养基中生长。胰岛素能够促进细胞利用葡萄糖和蛋白质，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是非常重要的细胞存活因子；优选地，干细胞无血清培养基中，胰岛素的浓度为1-15μg/ml。谷氨酰胺脱掉氨基后，可作为培养细胞的能量来源，并参与蛋白质的合成和核酸代谢，促进细胞的生长增殖；优选地，谷氨酰胺的浓度为1-5mmol/l。微量元素铁是细胞生长增殖所必需的，含铁的食品添加剂可以为转铁蛋白、柠檬酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中的一种或多种；优选地，含铁的食品添加剂为转铁蛋白，因为大多数哺乳动物细胞上均存在特定的转铁蛋白受体，转铁蛋白受体与转铁蛋白复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源，此外，转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其他微量元素如钒等结合，为细胞生长增殖提供必需的微量元素。优选地，干细胞无血清培养基中，含铁的食品添加剂的浓度为20-200ng/ml。进一步地，在细胞培养过程中，基础培养基中的酪氨酸、色氨酸、核黄素、抗坏血酸盐等会产生大量的过氧化氢，过氧化氢是细胞生长和克隆的主要毒性物质，会引起细胞膜上的饱和脂肪酸、细胞蛋白质氧化和/或DNA损伤而导致细胞死亡。因此，在本专利技术提供的干细胞无血清培养基中加入适量的亚硒酸钠，亚硒酸钠中的微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程，从而能够消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害；优选地，该干细胞无血清培养基中，亚硒酸钠的浓度为5-20nmol/l。孕酮能够刺激细胞的增殖，且能够促进细胞迁移，避免细胞贴壁生长造成的细胞部分无法接触到培养基的问题；优选地，孕酮的浓度为5-30mmol/l。丁二胺作为细胞培养中的微量元素和低分子量营养因子，是细胞膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质，能够促进细胞的生长增殖；优选地，丁二胺的浓度为10-100μmol/l。综上所述，本专利技术提供的干细胞无血清培养基不仅可避免血清培养基培养细胞所造成的病原体污染，以及细胞分离纯化等问题，而且能够促进细胞的生长增殖。进一步地，本专利技术提供的干细胞无血清培养基还包括青霉素，以及HEPES(中文名：羟乙基哌嗪乙硫磺酸，2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid，)，这些物质对于细胞的生长增殖均具有积极地促进辅助作用。其中，HEPES能够补偿培养基中无血清造成的缓冲能力下降，以维持细胞生长所需的酸碱度，优选地，HEPES的浓度为2-20mmol/l；青霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长，优选地，青霉素的浓度为10-100mg/ml。进一步地，本专利技术提供的干细胞无血清培养基还包括葡萄糖、NaHCO3、大豆胰酶抑制剂、亚油酸和链霉素。其中，葡萄糖是细胞生长增殖以及产物表达过程中的重要能量来源，优选地，葡萄糖的质量分数为0.1-1％。NaHCO3用于当细胞置于培养箱中培养时，调节培养基的PH值至7.2-7.4，优选地，NaHCO3的浓度为1-10mmol/l。大豆胰酶抑制剂在细胞传代过程中能够终止胰蛋白酶消本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干细胞无血清培养基，包括基础培养基，其特征在于：还包括胰岛素、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、孕酮和丁二胺。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞无血清培养基，包括基础培养基，其特征在于：还包括胰
岛素、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、孕酮和丁二胺。
2.根据权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述含铁
的食品添加剂包括转铁蛋白、柠檬酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中的一种或
多种。
3.根据权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述干细
胞无血清培养基中，胰岛素的浓度为1-15μg/ml、谷氨酰胺的浓度为
1-5mmol/l、含铁的食品添加剂的浓度为20-200ng/ml、亚硒酸钠的浓度为
20-50nmol/l、孕酮的浓度为5-30mmol/l和丁二胺的浓度为10-100μmol/l。
4.根据权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，还包括
HEPES和青霉素。
5.根据权利要求4所述的干细胞无血清培养基，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44