Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用制造技术

本发明专利技术属于癌症预后技术领域，具体涉及一种Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用。通过设计一系列预实验，收集了175例不同年龄、不同性别和不同肿瘤分级患者的ICC组织样本、15例癌旁组织样本以及15例正常肝内胆管组织样本。从Sall4表达水平与ICC临床病理特征的相关性方面，对Sall4在ICC中的作用做了初步探讨。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于癌症预后
，具体涉及一种Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用。
技术介绍
肝内胆管细胞癌(intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC)也称周围型肝内胆管癌或胆管细胞癌，原发于肝内二级以上胆管黏膜上皮细胞，是胆道系统最常见的恶性肿瘤之一。近几年ICC发病率在全球范围内仍呈增长趋势。其中我国胆管癌患病人数占全球胆管癌患者的55％。ICC恶性程度高，具有极强的侵袭和淋巴结转移特性，通常预后非常差，平均5年生存率为30％。相关研究显示，对于不可行手术切除的患者5年生存率<5％。当前手术切除是肝内胆管细胞癌早期最主要的治疗方式，也是唯一可能的治愈方式，然而其术后复发率也高达50％。化疗(如顺铂+吉西他滨)通常不理想，以5-FU和吉西他滨为主的治疗方式部分缓解率仅为20～30％。尽管已有研究发现ICC中可见某些基因如KRAS、PIK3CA、MET、EGFR、BRAF、NRAS和IDH等的异常表达，但ICC的发生发展、侵袭转移和血管生成等分子机制仍未十分明确。更好的了解ICC生物学行为的分子机制对于改善ICC患者的预后至关重要。Sall4是一个与多种肿瘤发病密切相关的原癌基因：Sall4基因最早在胚胎干细胞发现存在中高表达，对维持胚胎干细胞的多能性和自我更新具有重要作用，而且表达水平与细胞周期的进程显著相关。近年又有多项研究表明，Sall4可能与多种肿瘤(如肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌和淋巴瘤)的发生发展有着密切的关系[11,14-22]。尽管目前已有人研究过Sall4与肝细胞性肝癌的相关性，10％～20％的肝癌患者表达高水平的SALL4，但是50％的患者表达低水平的SALL4。但迄今为止，对Sall4与ICC的相关性还所知甚少。肝细胞性肝癌和肝内胆管细胞癌同属于原发性肝癌，但是二者无论在细胞起源、组织学发生和生物学行为方面，还是在临床病理学特点、治疗策略以及临床预后等方面均不相同。那么，Sall4是否可能也参与了ICC的发生和发展，并有可能与患者的预后存在一定的相关性呢？为此，本专利技术设计了一系列预实验，收集了175例不同年龄、不同性别和不同肿瘤分级患者的ICC组织样本、15例癌旁组织样本以及15例正常肝内胆管组织样本。从Sall4表达水平与ICC临床病理特征的相关性方面，对Sall4在ICC中的作用做了初步探讨。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肝内胆管细胞癌预后的标志物，以及该标志物在制备该种癌症预后和干扰制剂中的应用。Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用，所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的淋巴转移、血管浸润和神经浸润方面预后的制剂。通过Sall4的表达控制PTEN和Bmi-1信号途径调控肝内胆管细胞癌的侵袭和转移。Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移预后的制剂。通过Sall4的表达控制E-钙黏连蛋白和N-钙黏连蛋白的表达，从而调控肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移。预后制剂包括：划痕实验检测、Transwell实验检测、Westernblot检测、石蜡组织芯片检测、PCR检测、原位杂交检测制剂。PCR检测试剂引物序列如下：正向引物：AGCACATCAACTCGGAGGAG逆向引物：CATTCCCTGGGTGGTTCACTG。Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌复发和转移的制剂的应用，通过Sall4基因序列设计用于下调肝内胆管细胞癌的癌细胞中Sall4表达的干扰RNA，所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌淋巴转移、血管浸润和神经浸润的制剂。Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移的制剂。本专利技术的有益效果：1、为临床判断肝内胆管癌的预后提供基因分型基础；2、改善肝内胆管癌患者的预后。附图说明图1：Sall4在癌组织、癌旁组织和正常肝内胆管组织中的表达；ICC表示ICC病灶组织样本，Per表示与之前ICC病灶组织相对应的癌旁组织样本，Con表示正常肝内胆管组织样本；图2：Kaplan-Meier总体生存分析结果；图3：划痕实验结果；图4：Transwell实验结果；图5：E-钙黏连蛋白和N-钙黏连蛋白表达的Westernblot结果；图6：PTEN和Bim-1蛋白表达的Westernblot结果。具体实施方式以下结合实施例旨在进一步说明本专利技术，而非限制本专利技术。实施例(一)PCR检测正向引物：AGCACATCAACTCGGAGGAG逆向引物：CATTCCCTGGGTGGTTCACTG。操作步骤1.提取细胞DNA2.反应程序：试剂浓度加入量10倍浓度PCR缓冲液2.5ul氯化镁溶液2.5mmol/L2.5uldNTP混合液各2.5mmol/L2.5ul上游引物2.5umol/L2.5ul下游引物2.5umol/L2.5ulTsgDNA聚合酶2.5U细胞DNA25-50ng2.5ul超纯水10ul总体积25ul将反应试剂加入EP管中轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子打开PCR反应仪输入以下反应数据●94℃预变性5min●94℃变性40s●40℃退火40s●72℃延伸1min将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min(二)划痕实验：在6孔板种入大约5×105个细胞(以过夜能铺满为宜)，第二天用枪头比直横线划痕。PBS洗细胞3次去除划下的细胞。加入无血清DMEM高糖培养基,于37℃5％CO2培养箱培养。按0，6，12，24小时取样拍照；(三)侵袭实验：用融化的Matrigel原液和预冷无血清DMEM高糖培养液配制0.8μg/μlTranswellchamber上室凝胶液，以每孔100μl包被Transwell上室，37℃培养箱中放置2小时使其成固化胶，制成侵袭小室。胰酶消化实验细胞并收集计数，用无血清DMEM高糖培养基稀释成1×106/ml细胞悬液，每孔Transwell上室加入100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％FBS的完全DMEM培本文档来自技高网...

【技术保护点】
Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用，其特征在于，所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用，其特征在于，所述的Sall4基因
序列如SEQ:NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的
淋巴转移、血管浸润和神经浸润方面预后的制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过Sall4的表达控制PTEN和Bmi-1信号
途径调控肝内胆管细胞癌的侵袭和转移。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的
癌细胞的远处转移预后的制剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过Sall4的表达控制E-钙黏连蛋白和N-
钙黏连蛋白的表达，从而调控肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，预后制剂包括：划痕实验检测、
Transw...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓刚，黄飞舟，朱垒，徐宏博，黄为，
申请(专利权)人：中南大学湘雅三医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43