一种三倍体矮牵牛的培育方法技术

本发明专利技术公开了一种三倍体矮牵牛的培育方法，包括以下步骤：选择杂种优势强的二倍体矮牵牛组合作为杂交亲本，在父本开花期选择适当大小的花蕾，用秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵混合药液进行化学诱变促使形成2n花粉，将2n花粉授粉到二倍体母本柱头上得到F1杂交种子，同时将父本没有经化学诱变处理的n花粉与母本杂交得到对照二倍体F1杂交种子。F1杂交种子发育的成株与对照二倍体F1杂交后代进行农艺性状、解剖学比较，在此基础上再进行染色体数目检测，最终确定三倍体植株。本发明专利技术育种周期短、操作简便诱变效率高，具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于园艺植物遗传育种领域，特别涉及。
技术介绍
矮牵牛（Petunia hybrida Vilm.)为前科碧冬前属植物，为一年生草本花丼。矮 牵牛花朵硕大，色彩丰富，花型变化颇多，目前矮牵牛在国际上已成为主要的盆花和装饰植 物，广泛应用于庭院、露天花坛、广场的美化装饰与绿化，被喻为"世界花坛花卉之王"。我国 矮牵牛于20世纪初开始少量引种栽培，80年代逐渐从欧美等国引进新品种进行规模种植， 现在随着经济发展和城市建设需要对矮牵牛需求越来越大，目前国内广泛种植的优良矮牵 牛品种如重瓣"双瀑布"系列、大花"梦幻"系列、多花单瓣"庆典"系列和吊蓝等系列都为国 外培育的二倍体品种。 通过倍性育种可使植物基因组多倍化获得生长势旺盛、适应性强、抗逆性好的品 种，应用于观赏植物可提高花卉的观赏性与品质。三倍体是指体细胞中含有三个染色体 组，不但具有多倍体的优良特性而且可以利用杂种优势、获得无籽果实，并且作为遗传育种 桥梁材料选育出的系列单体和三体可应用于染色体上基因定位、确定基因连锁群等遗传研 究。培育三倍体一般先诱导形成遗传稳定的四倍体，再由四倍体和二倍体杂交获得三倍体， 此法育种周期较长。迄今为止，还没有三倍体矮牵牛（2n = 3x = 21)培育方法的公开报道。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术要解决的技术问题是提供。此种 方法育种周期短、操作简便诱变效率高。 技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了， 该方法包括如下步骤： 1)选择杂交优势较强的二倍体组合作为亲本，按常规技术种植； 2)在亲本进入花期时，用化学诱导剂诱导父本植株上的花蕾，使之产生2n花粉； 3)诱导后花蕾纵轴长度生长至1. 5cm~2. 6cm时，采摘放置于低温、干燥、黑暗处 保存； 4)杂交前对母本进行去雄处理，将步骤3)中诱导花蕾中的2n花粉取出，涂于母本 去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到F1杂交种子；同时将父本没有经过诱导处理的n花粉 涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到对照二倍体 Fl杂交种子； 5)将Fi杂交种子生长至成植，筛选出三倍体植株。 其中，上述的化学诱导剂为秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵的混合药液。秋水仙素的最 终质量浓度为0. 1%~0. 5%，氨磺灵最终质量浓度为20mg. L 1~50mg. L \氟乐灵最终质 量浓度为50mg. L 1~100mg. L、 其中，上述步骤2)诱导的方法为：上午8~10时温室大棚内温度控制在22~ 33°C，选择父本植株上纵轴长度为2. 2mm~3. 4mm花蕾，用微量注射器将化学诱导剂混合药 液注入花蕾内，每次10~15yL，连续1~3天。 步骤3)具体方法为：采摘经诱导处理纵轴长度生长至1. 5cm~2. 6cm的花蕾，放 置于密闭的容器中（内含无水氯化钙或无水硫酸镁或硅胶等干燥剂），并用黑色遮光物覆 盖，将容器放置于冷柜中温度设置为3~10°C，可存放1~3天，等待授粉的合适时机。 步骤4)中，杂交前对母本进行去雄处理，是指杂交前选择母本植株上纵轴长度达 2. 5厘米或以上的未开花花蕾，对花蕾进行去除雄蕊后套袋隔离，1~3天后进行杂交授粉； 父本没有经过经过诱导处理的n花粉，是指选择父本植株上没有经化学药剂处理、纵轴长 度达2. 5厘米或以上的未开花花蕾，进行套袋隔离，1~2天后取花粉进行授粉。 其中，上述步骤5)的筛选方法为：将匕杂交种、对照二倍体Fi杂交种按常规技术 种植，成株后先进行农艺性状、解剖学比较，选择多倍体特征明显的植株，再进行细胞学染 色体检测确定三倍体植株。 其中，上述步骤1)中杂交优势较强的二倍体组合是指匕杂交后代的株高、冠幅、 茎粗、叶面积、开花数的农艺性状超过双亲。 其中，上述步骤3)中，低温、干燥黑暗处是指3~10°C、干燥剂干燥和遮光。 其中，上述步骤5)中农艺性状为：叶片长度与宽度、叶面是否扭曲、茎粗、株高、冠 幅、萼片长度与宽度、柱头和花药大小、花瓣直径、花瓣边缘褶皱程度。 步骤5)农艺性状鉴定指，在Fi杂交群体中选择第5~10片真叶平均长度与宽 度、主茎粗、株高、冠幅、萼片长度与宽度、柱头直径、花药长度与宽度、花瓣直径其中有任意 5项或5项以上数值显著大于对照二倍体匕杂交种，同时叶面扭曲、花瓣边缘波状褶皱程度 明显大于对照二倍体匕杂交种的植株。 其中，上述步骤5)中解剖学观察性状有气孔和花粉细胞，观察气孔方法为：将叶 片背面表皮撕下，在显微镜下测量表皮气孔大小；观察花粉细胞方法为：对成熟花粉进行 染色，在显微镜镜下测量成熟花粉细胞大小。解剖学中气孔鉴定指，用尖头镊子将叶片背面 表皮撕下，放置于载玻片上，滴1~2滴清水在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的 目镜测量气孔长与宽度，选择长、宽度显著大于对照二倍体匕杂交种的植株。 花粉细胞鉴定指：从开放花朵中取少量成熟花粉，放置于载玻片上，滴1~2滴质 量浓度为1%醋酸洋红染色3~5分钟，在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜 测量花粉细胞大小，选择花粉平均直径、不育花粉率（形状畸形和不染色）明显大于对照二 倍体？ 1杂交种的植株。 其中，上述步骤5)中细胞学染色体检测方法为： 晴天上午8~10时取长度3. 1~7. 3謹的幼蕾，立即放入装有0? 002mol. L V羟 基喹啉水溶液0~10°C容器中，放置在0~10°C的冷柜中预处理1~5小时，蒸馏水冲洗 3~5次后转入卡诺氏固定液固定12~24小时，蒸馏水冲洗3~5次，lmol. L iCl溶液 50~60°C水浴解离3~6分钟，蒸馏水冲洗3~5次用滤纸吸干水，放入体积百分浓度为 45%的醋酸溶液配制的质量浓度1 %的洋红染色液染色12~24小时，用镊子将幼蕾移入干 净的载玻片上，用刀片切取雌蕊子房，用镊子取子房中心部位少量分生组织，放置于载玻片 上，滴1~2滴1%洋红染色液，盖上盖玻片，先在低倍镜下寻找有丝分裂中期分裂相视野， 然后在100倍油镜下进行染色体计数，选择体细胞染色体数目2n = 3x = 21的三倍体植株。 其中，上述卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。 其中，上述体积百分浓度45%醋酸溶液配制的质量浓度1%的洋红染色液配制方 法为：先加入45ml乙酸再加水55ml，混匀后将洋红粉末1克缓慢倒入100ml 45 %醋酸溶液 中，边煮边搅拌，煮沸冷却后过滤即可使用。 有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1、现有技术大多先诱导形成四倍体再与二倍体杂交形成三倍体，本专利技术所述方法 通过直接诱导矮牵牛二倍体形成2n花粉再与二倍体杂交形成三倍体，显著缩短育种时间， 操作简便易行；对2n花粉进行低温保存延长了花粉活力，解决花期不遇，方法简单易行。 2、诱导剂的选择：本专利技术采用秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵混合液为诱导剂，通过干 扰纺锤丝形成从而抑制细胞有丝分裂使染色体加倍，三者混合使用后可提高2n花粉诱导 率。【附图说明】 图1在100倍油镜下观察三倍体植株子房分生组织体细胞的染色体数目，2n= 21 ；【具体实施方式】 下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施 例。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1) 选择杂交优势较强的二倍体组合作为亲本，按常规技术种植；2) 在亲本进入花期时，用化学诱导剂诱导父本植株上的花蕾，使之产生2n花粉；3) 诱导后花蕾纵轴长度生长至1.5cm~2.6cm时，采摘放置于低温、干燥、黑暗处保存；4) 杂交前对母本进行去雄处理，将步骤3）中诱导花蕾中的2n花粉取出，涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到F1杂交种子；同时将父本没有经过诱导处理的n花粉涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到对照二倍体F1杂交种子；5) 将F1杂交种子生长至成植，筛选出三倍体植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏跃，樊开青，陈啸寅，颜志明，王全智，贾思振，史红林，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32