牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒。本试剂盒使用了申请单位上世纪60年代诱导驯化的猪种布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原，提高了检测的敏感性；本研究改进了LPS纯化和纯度测定的方法，使开发的试剂盒具有良好的特异性，该试剂盒不仅能有效排除常规革兰氏阴性细菌对布鲁氏菌的干扰，而且能排除一般布病间接ELISA试剂盒无法区分小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157干扰的技术缺陷，提高了检测的特异性。本发明专利技术通过对主要试剂配方的改进和优化，不仅有效控制试剂盒的反应背景，而且缩短了检测所需的时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种动物布鲁氏菌病的诊断方法--牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测 试剂盒，属生物制品检测
技术背景 布鲁氏菌病（布病）是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌（Brucella)引起的以流产和发 热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖 和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重 的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的 目标之一。 布病在世界存在已有久远的历史，人类对该病的研究认识逐步加深，诊断水平不 断提高，随着动物布病的研究进展，动物布病血清学的检测方法不断改进和提高。传统的凝 集试验（如：虎红抗原平板凝集试验、试管抗原凝集试验、乳环凝集试验）逐渐被敏感性高、 特异性强的ELISA方法、荧光偏振试验（FPA)等新的检测技术所取代。 凝集试验是布鲁氏菌病诊断的一种常用的方法，包括血清凝集实验、乳环沉淀试 验和抗人免疫球蛋白试验，其中经典的标准试管凝集试验（STAT)、平板凝集试验（PAT)，以 上方法在发达国家已经基本停止使用，取而代之的是缓冲布鲁氏菌抗原凝集试验如虎红平 板凝集试验（RBPT)。虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心 收集菌体后用虎红染料染色后悬浮于乳酸缓冲液中制成，该方法灵敏度高，价格便宜，操作 方便，检测快速，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检 测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。乳环沉淀试验依然是乳牛布鲁氏 菌监测的主要方法，该方法直接对牛乳进行检测，可以对奶牛群体进行筛检，该方法简便快 速。凝集试验主要检测抗布鲁氏菌LPS- 0链的抗体，而布鲁氏菌的LPS- 0链是多种革 兰氏阴性菌的共同抗原，因此布鲁氏菌与其他革兰氏阴性菌存在的交叉感染用试管凝集试 验无法鉴别，这也是布鲁氏菌病诊断存在的一大难题。 在布鲁氏菌病血清学检验中一致认为补体结合试验（CFT)在特异性上优于其他 方法，常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试验检测为阳性或可疑的病例进行定性检 测。补体结合试验一直被认为是最有效的布病诊断方法，至今尚没有一种诊断方法能取代 补体结合试验在血清学诊断中的地位。但补体结合试验所需要的溶血素的制备困难，试验 操作繁琐，难以在临床上普遍使用，而且由于猪体内的补体会干扰豚鼠补体的作用，导致敏 感性下降。 ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较 好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为 确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。牛布鲁 氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，该方法解决了常规方法耗时 费力的不足，提高了检测的特异性、敏感性和便捷性。用于布鲁氏菌病检测的ELISA有间接 ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)两种。目前研究报道的或已经商业化生产的布鲁氏 菌iELISA和cELISA试剂盒存在的主要技术缺陷在于不能有效排除耶尔森氏菌09和大肠 杆菌0157感染动物的血清干扰，从而使其特异性受到一定程度影响。申请人曾经筛选获得 了一株只与布鲁氏菌反应，不与耶尔森氏菌09和大肠杆菌0157反应的特异性单克隆抗体， 并在此基础上开发了动物布鲁氏菌cELISA试剂盒，该技术不仅已经获得了专利证书（专利 号：ZL201310213811. 5)，而且已经完成了中试、临床试验，并通过了新兽药评审初审，正在 进行制品的质量复核检验。本专利技术主要是通过筛选特定布鲁氏菌，提取其脂多糖（LPS作为 包被抗原，并对包被抗原提纯工艺以及试剂盒组分进行优化，成功开发了高特异性和敏感 性的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，丰富了我国布病诊断技术。 2013年，山东奶牛中心公布了一种"牛布鲁氏菌间接ELISA检测试剂盒"的专利技术 专利，在该试剂盒中，使用了大肠杆菌表达的布鲁氏菌特异性VirbS蛋白作为包被抗原进 行布病检测。虽然Virb8蛋白为布鲁氏菌所特异，但是在人工感染模型中，只有特定动物在 感染特定种属布鲁氏菌后才能产生针对VirbS的抗体。也就是说VirbS抗体产生具有感染 宿主和布鲁氏菌种属的特异性，能够检测到VirbS蛋白抗体的牛很可能感染了布鲁氏菌， 但更多情况是感染了布鲁氏菌但未产生针对VirbS蛋白的抗体，从而使该试剂盒存在较高 比例漏检。LPS是布鲁氏菌最主要的特异性抗原，在感染动物体内产生强烈的抗体反应，相 对于布鲁氏菌各种外膜蛋白或功能蛋白，LPS抗体占有几乎绝对的优势，通过检测布鲁氏菌 LPS抗体是布鲁氏菌检测的可靠方法，也是国际通行做法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种牛布鲁氏菌诊断的高通量抗体检测技术，其核心是采 用猪种布鲁氏菌S2株LPS代替国外同类诊断技术中采用的A99株LPS，提高了检测的敏感 性；通过改进LPS纯化和纯度测定方法，能有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌09和大肠杆菌 0157对布鲁氏菌病检测的干扰，以及具有良好特异性和敏感性的牛布鲁氏菌高通量的检测 试剂盒。 本专利技术的技术路线是选取我国独有的布鲁氏菌S2株，以此菌株提取的LPS具有良 好的敏感性，本研究同时发现以布鲁氏菌S2株提取LPS其产量高于以A99和S1119株的产 量，能有效降低生产成本；本专利技术在常规提取LPS方法的基础上，增加了蛋白酶K消化和苯 酚抽提步骤，有效提高了LPS纯度；采用标准曲线和0D529nm吸光度值相结合的方法，建立 了LPS纯度检测方法；通过上述技术改进，使本专利技术建立的ELISA方法能一般革兰氏阴性细 菌以及耶尔森氏菌09和大肠杆菌0157对布鲁氏菌病检测的干扰；另外，经配方优化处理， 使试剂盒背景控制良好，并缩短了检测时间，提高了检测效率。 本专利技术利用布鲁氏菌S2株LPS作为包被抗原，以人工免疫健康牛制备阳性血清， 以采集健康非免疫牛血清作阴性血清，以HRP标记兔抗牛IgG、底物溶液、终止液、样品稀释 液、HRP标记兔抗牛IgG稀释液及20X洗涤液等组分组装而成。 本专利技术技术方案 1. -种牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒主要含有：以制备的光 滑型猪种布鲁氏菌S2株的脂多糖（LPS)作为包被抗原，以人工免疫健康牛制备阳性血清， 以采集健康非免疫牛血清作阴性血清，以HRP标记兔抗牛IgG、底物溶液、终止液、样品稀释 液、HRP标记兔抗牛IgG稀释液及20X洗涤液等组分组装而成，用于检测牛血清中的光滑 型布鲁氏菌抗体。其中： (1)该试剂盒中使用的包被抗原LPS来源于猪种布鲁氏菌（S2株），该LPS对猪、 牛、羊布鲁氏菌病的病原菌具有良好的敏感性，提高了试剂盒检测的敏感性； (2)LPS提取过程中增加了蛋白酶K消化和苯酚抽提步骤，提高了LPS纯度，减少 了LPS中阴杂蛋白含量过高导致的非特异性反应；本试剂盒不仅能有效排除常规革兰氏阴 性细菌对布鲁氏菌的干扰，而且能排除一般布病间接ELISA试剂盒无法区分小肠结肠炎耶 尔森氏菌09和大肠杆菌0157干扰的技术缺陷，提高了检测的特异性； (3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要含有：以制备的光滑型猪种布鲁氏菌S2株的脂多糖(LPS)作为包被抗原，以人工免疫健康牛制备阳性血清，以采集健康非免疫牛血清作阴性血清，以HRP标记兔抗牛IgG、底物溶液、终止液、样品稀释液、HRP标记兔抗牛IgG稀释液及20×洗涤液等组分组装而成，用于检测牛血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。其中：(1)该试剂盒中使用的包被抗原LPS来源于猪种布鲁氏菌(S2株)，该LPS对猪、牛、羊布鲁氏菌病的病原菌具有良好的敏感性，提高了试剂盒检测的敏感性；(2)LPS提取过程中增加了蛋白酶K消化和苯酚抽提步骤，提高了LPS纯度，减少了LPS中阴杂蛋白含量过高导致的非特异性反应；本试剂盒不仅能有效排除常规革兰氏阴性细菌对布鲁氏菌的干扰，而且能排除一般布病间接ELISA试剂盒无法区分小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157干扰的技术缺陷，提高了检测的特异性；(3)LPS的包被量基于对其纯度和质量的测定；(4)本专利技术通过对主要试剂配方的改进和优化，有效控制试剂盒的反应背景，缩短了检测所需的时间。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁家波，王芳，冯宇，朱良全，王楠，毛开荣，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11