本发明专利技术涉及一种新的EPSPS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，以及该EPSPS基因的表达产物，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；本发明专利技术还涉及一种抗除草剂基因CTP2-EPSPS，含有叶绿体转运肽CTP2和权利要求1所述EPSPS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，以及其表达产物、表达载体和其在培育抗草甘膦转基因玉米中的应用。本发明专利技术抗除草剂基因可在作物中稳定表达、且表达量高、耐除草剂效果好，能转化玉米或其它植物，从而提高玉米等植物的耐除草剂特性，为解决玉米等植物生产中的耐除草剂特性提供一条有效途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因生物工程领域，具体涉及一种新的5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(没^75)基因、其表达载体、表达产物及其在培育抗草甘膦转基因玉米中的应用，它对那些在没^7没活性中作为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)竞争性抑制剂的除草剂表现出增强的抗性。
技术介绍
5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶{EPSP$)是细菌、真菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键酶，在莽草酸途径中催化底物磷酸稀醇式丙酮酸(phosphoenolpyruate，PEP)和莽草酸_3_磷酸(shikimate-3-phosphate, S3P)合成5_稀醇式丙酮酰莽草酸_3_磷酸(EPSP)。草甘膦是底物PEP的结构类似物，可以竞争性地与EPSP激令，从而抑制活性，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，扰乱生物体正常的氮代谢而使其死亡。方/?/?只在植物和微生物中存在，在动物中不存在。植物可以通过转化对草甘膦具有耐受能力的EPSPSm因而获得抗草甘膦的能力，而根癌农杆菌CP4的方/?'/?'已经在植物中得到广泛的验证和应用。€/?/?主要分为两种类型:1型和II型。I型主要来源于植物和大肠杆菌，对草甘膦敏感；II型通常来源于对草甘膦有一定耐受性的微生物，对草甘膦的敏感性较差，有一定的草甘膦抗性。目前，植物获得草甘膦抗性主要采用3种方法:(I)通过超表达€/?/?基因使得植物细胞对一定剂量的草甘膦产生抗性；(2)通过方/?/?的作用活性位点变化，改变其空间构型，一方面降低其与草甘膦的亲和能力，另一方面提高其与底物PEP和S3P的亲和能力，使植物细胞产生草甘膦抗性；(3)通过导入草甘膦降解基因，比如利用草甘膦乙酰转移酶将草甘膦乙酰化，从而使草甘膦失活的机制。80年代美国孟山都(Monsnato)公司以其拥有广谱、高效除草剂农达(草甘麟)的优势而率先开始除草剂抗性基因的转移研究与抗性品种的开发。自此促进了全球抗除草剂转基因研究的蓬勃发展，抗除草剂种类不断增加，抗性品种范围快速扩大。国内进行耐除草剂基因研究主要集中于方/?/?基因。中山大学利用鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌基因的重组，获得突变后与原底物亲和力增大，而对草甘膦亲和力下降的方(He et al,2001)。北京大学王忆平课题组获得了一个新型高效抗草甘膦基因4G-1 aro儿该基因在核酸水平上与已知基因没有同源性，在氨基酸水平上只有37%左右的相似性，为耐草甘膦转基因作物的研究提供了候选基因(Sun et al, 2005)。中国农业科学院林敏课题组从长期被草甘膦污染的土壤中分离到一株草甘膦耐受菌株-荧光假单胞菌G2，其草甘膦耐受浓度为150mmo 1/L，并从中克隆了编码EPSPS的G2aro4基因。中国农业大学国家玉米改良中心赖锦盛课题组，在极端污染的土壤中得到高抗草甘膦的菌株并从中克隆到细菌方/?/?基因，通过定点突变植物内源基因获得抗草甘膦的方/?/?基因。目前，生产上常用的CP4- EPSPS基因，来自土壤农杆菌CP4，是通过细菌培养筛选分离出来的抗性优良的基因。应用的I型没5/?基因主要是AcWi和玉米的€/?/?基因，基因种类单一稀少。因此，寻找新型高抗草甘膦基因是培育抗草甘膦转基因作物的一个重要途径。玉米是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，农田杂草给玉米生产带来严重的干扰和损失，造成玉米大量减产，因此采取有效措施控制其危害对提高玉米产量、增加农民收入具有重要的意义。草甘膦是一种施用于叶片的、广谱的、非选择性的有机磷类除草剂，它对于许多一年生和多年生杂草都有极强的控制能力。但是，这种对重要农田杂草活性强的除草剂对农作物的伤害更大，除草剂消灭杂草和不伤害作物的选择性很难获得，培养和选育抗除草剂品种才是最根本最方便的控制杂草的方法。因此，寻找新型具有自主知识产权的高抗草甘膦基因以及培育新型抗除草剂转基因玉米是解决上述问题的最有效途径之一。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可在作物中稳定表达、且表达量高、耐除草剂效果好的EPSPS^因及其编码蛋白，并将其应用于表达载体、宿主细胞的转化构建等。本专利技术的另一目的是将改造抗除草剂基因€/?/?转化玉米或其它植物，从而提高玉米等植物的耐除草剂特性。通过转基因及常规育种手段，把抗除草剂基因EPSP雜}产中普遍应用的骨干自交系中，为解决玉米等植物生产中的耐除草剂特性提供一条有效途径。为解决上述技术问题，本专利技术通过以下技术方案实现: 在对细菌培养筛选分离出来自土壤农杆菌抗性优良的基因CP4-方(SEQ ID N0.1)进行的大量改造试验研究过程中，发现采用以下方法和步骤获得了预料不到的技术效果:用部分的密码子置换序列相对应的密码子，排除常用限制性酶切位点(SacI和Xbal)，然后通过置换密码子的方法进行改正消除，并在3端加上终止密码子TAG，并通过人工合成的方法实现第二位丝氨酸到亮氨酸的氨基酸突变，获得了一个改造后的突变的方/?/?基因序列(如SEQ ID N0.2所示)，其对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。另外，在改造的方/?/?基因5端前面加上了 CTP2的叶绿体导肽序列(SEQ IDN0.4);然后确定并化学合成抗除草剂基因CTP2-方/?/?;如序列表SEQ ID N0.5所示的编码序列；研究表明，在植物细胞中，基因存在于细胞核中，但成熟蛋白位于叶绿体内，信号肽位于€/?/?前体的N端，引导其进入叶绿体基质后被水解，前体蛋白成为成熟的EPSPS'进一步研究发现，叶绿体转运肽对方/^7说于使正常功能是必须的，在蛋白结构及功能一致的前提下，如果去掉信号肽，植物组织中EPSPS蛋白表达量一致，但植株的草甘膦抗性不同，带有信号肽的EPSPS蛋白草甘膦抗性更强。根据基因功能分析的需要，进一步对合成的产物进行PCR克隆并测序，并将合成正确的基因装载在质粒载体PUC57上。本专利技术进一步的构建了包含35S启动子的DNA，该启动子在植物细胞中有启动目的基因表达的功能，可以有效地与改造后的€/?/?基因连接。本专利技术还研究了培育转基因植物的方法，包括将本专利技术基因与植物表达载体可操作地连接，在允许植物表达载体能被受体植物细胞摄取的条件下，将受体细胞与植物表达载体共同培养；选择包含植物表达载体的受体细胞；受体细胞经过选择、再生、炼苗等阶段，获得转基因苗，得到耐受草甘膦的转基因植物。本专利技术的又一个方面是包含具有改造的€/?/?植物表达载体的耐受草甘膦的转基因植物，以其与其它植物杂交，获得的耐受草甘膦的子代植物。本专利技术的又一方面是将改造的方/?/?基因转化玉米、棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗除草剂活性。例如，利用上述基因培育抗草甘膦转基因玉米的方法，包括如下步骤: (1)基因合成:人工合成上述编码突变的EPSPSm因或抗除草剂基因CW2-EPSPS,并将其装载在质粒载体pUC57上，得到含有CTP2基因的pUCCTP2_ EPSPS载体质粒； (2)植物表达载体构建 ①用限制性内切酶5'%?酶切T载体质粒pUCCTP2-EPSPS,用凝胶回收纯化试剂盒回收CTP2-没5/?片段；同时用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切植物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码突变的EPSPS基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：岳润清，铁双贵，卢彩霞，齐建双，韩小花，燕树锋，刘璐，陈娜，池海锋，傅晓雷，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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