使用特异性报告物和通用报告物的多重数字分析制造技术

提供了用于执行分块中的靶分析的数字分析系统，包括方法、装置和成分，每个分块包含用于靶扩增的通用报告物和特异性报告物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用特异性报告物和通用报告物的多重数字分析优先权申请的交叉引用本申请基于下列专利申请并根据美国法典第35篇第119条e款要求下列专利申请的利益：2013年2月1日提交的美国临时专利申请序列号61/759,772、2013年2月1日提交的美国临时专利申请序列号61/759,930和2013年2月1日提交的美国临时专利申请序列号61/759,931。这些优先权申请中的每个为了所有目的通过引用被全部并入本文。其它材料的交叉引用本申请为了所有目的通过引用全部合并下列材料：2006年5月9日颁布的美国专利号7,041,481、2010年7月8日公布的美国专利申请公布号2010/0173394A1、2011年9月8日公布的美国专利申请公布号2011/0217712A1、2012年6月21日公布的美国专利申请公布号2012/0152369A1、2013年2月14日公布的美国专利申请公布号2013/0040841A1、2013年12月6日提交的美国专利申请序列号14/099,750以及JosephR.Lakowicz的“PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy”(1999年第二版)。介绍数字分析通常依赖于检测在样本中的分析物的单独拷贝的存在或活动的能力。在示例性数字分析中，样本分成通常具有相等体积的一组分块，每个分块平均包含分析物的少于大约一个拷贝。如果分析物的拷贝随机地分布在分块当中，则一些分块应不包含拷贝，其它分块只包含一个拷贝，以及如果分块的数量足够大，又一些其它分块应包含两个拷贝、三个拷贝和甚至更高数量的拷贝。通过泊松分布描述了基于在分块中的分析物的给定平均浓度来找到在分块中的确切地0、1、2、3或更多拷贝的概率。相反，可从找到在分块中的给定数量的拷贝的概率估计在分块中(和因而在样本中)的分析物的浓度。可在数字分析中测量找不到拷贝和找到一个或多个拷贝的概率的估计。每个分块可被测试以确定分块是包含分析物的至少一个拷贝的阳性分块还是不包含分析物的拷贝的阴性分块。找不到分块中的拷贝的概率可由阴性的被测试的分块的分数(“阴性分数”)近似，以及找到至少一个拷贝的概率由阳性的被测试的分块的分数(“阳性分数”)近似。阳性分数或阴性分数于是可用于例如使用泊松统计来确定分块中的分析物的浓度。数字分析频繁地依赖于分块中的核酸靶的扩增以使分析物的单个拷贝的检测变得可能。可经由聚合酶链反应(PCR)进行扩增以实现数字PCR分析。所扩增的靶可以是分析物本身或在分块的形成之前或之后产生的分析物的替代物。可以可选地从包括在反应中的荧光探针检测靶的扩增。特别是，探针可包括提供指示靶是否被扩增的荧光信号的荧光团。数字PCR分析可以是多重的以允许在每个分块内的两个或多个不同的靶的检测。可通过利用靶特定探针来区分靶的扩增。然而，这样的探针可能是昂贵的且需要被定制合成，如果不是已经在市场上可买到，进一步增加来成本。需要用于使用较少的靶特定探针来执行更多靶的多重数字分析的新方法。概述本公开提供了用于执行分块中的靶分析的数字分析系统，包括方法、装置和组成物，每个分块包含用于靶扩增的通用报告物和特异性报告物。附图的简要说明图1是根据本公开的方面的在包含通用报告物的分块中的靶上执行多重数字分析的示例方法的流程图，可选地，至少一个靶是至少部分地掩蔽在包含模糊靶和被掩蔽靶的分块中的另一靶的存在的模糊靶。图2是根据本公开的方面的用于执行图1的多重数字分析的示例性系统的示意图。图3是根据本公开的方面的可在单个检测通道中从共同包含与较高振幅信号相关的模糊靶(H)和与较低振幅信号相关的被掩蔽靶(L)的分块例如液滴收集的多重分析数据的示意性图表。图3A是根据本公开的方面的可如在图3中的被收集的多重分析数据的示意性图表，但双-阳性分块(HL、HLL等)的群体展示在只包含靶H的分块的群体上的信号振幅的小的可检测到的增加，信号振幅的增加不足以分辨来自彼此的两个较高振幅群体，使得靶L仍然至少部分地由靶H的存在掩蔽。图4是根据本公开的方面的通常可如在图3中的被收集的多重分析数据的示意性图表，但模糊靶(L)就具有比被掩蔽靶(H)低的振幅信号。图5是根据本公开的方面的可在单个检测通道中从共同包含根据掩蔽等级结构连续地掩蔽彼此的K个靶的分块例如液滴收集的多重分析数据的示意性图表。图6是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有不同的长度的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在不同的效率下可以用同一对正向(F)和反向(R)引物扩增且可经由同一探针(P)检测。图7是根据本公开的方面的来自能够产生图4的数据的示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有不同的长度的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在不同的效率下可用同一对正向(F)和反向(R)引物扩增且可经由扩增子(例如嵌入染料)的相同的通用报告物检测。图8是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的另一示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有相同的长度的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在不同的效率下可用同一对正向(F)和反向(R)引物扩增且可经由同一探针(P)检测。图9是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的又一示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有相同的长度的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在相同的效率下可用同一对正向(F)和反向(R)引物扩增且可在不同的效率下经由同一探针(P)检测。图10是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的再一示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含模糊靶的拷贝和被掩蔽靶的拷贝，每个在不同的效率下可用不同对的正向和反向引物(FH和RH或FL和RL)扩增且可经由不同的探针(PH和PL)检测。图11是根据本公开的方面的来自使用单个检测通道执行的示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含靶A和靶B的拷贝，每个可用不同对的正向和反向引物(FA和RA或FB和RB)扩增且可经由通用报告物(例如嵌入染料)检测。图11A是根据本公开的方面的可为图11的多重数字分析在单个检测通道中从五组分块(线道1-5)收集的荧光振幅数据的示意性图表，每组包含相同浓度的靶A和B、正向引物A和反向引物A和B以及靶B的可变浓度的正向引物B。图12是根据本公开的方面的来自使用两个检测通道执行的示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含被掩蔽靶A的拷贝和掩蔽靶B的拷贝，每个在不同的效率下可用不同对的正向和反向引物(FA和RA或FB和RB)扩增且可经由具有不同荧光团标签的不同的探针(PA和PB)检测。图12A是根据本公开的方面的可从图12的多重数字分析收集的扩增数据的示意性散布图，分块的三个不同的簇被顺序地编号并根据靶内容被识别。图13是根据本公开的方面的来自使用两个检测通道执行的另一示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含被掩蔽靶(A)的拷贝和掩蔽靶(B)的拷贝，每个可用不同对的正向和反向引物(FA和RA或FB和RB)扩增且可经由通用报告物(例如嵌入染料)和特异性探针(PB)检测。图14是根据本公开的方面的可从图13的多重数字分析收集的扩增数据的示意性散布图，分块的三个不同的簇被顺序地编本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种执行多重数字分析的方法，所述方法包括：提供分块，每个分块包括同一混合物的一部分，所述混合物包含第一靶和第二靶且也包含对任一靶的扩增敏感的通用报告物和对所述第二靶的扩增特异地敏感的特异性报告物，其中只有所述分块的第一子集每个包含所述第一靶的至少一个拷贝，且所述分块的仅仅不同的第二子集每个包含所述第二靶的至少一个拷贝；扩增在所述分块中的所述第一靶和所述第二靶；从存在于多个所述分块中的所述通用报告物和所述特异性报告物收集扩增数据；以及基于所述扩增数据计算每个靶的水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.02.01 US 61/759,930;2013.02.01 US 61/759,931;1.一种执行多重数字分析的方法，所述方法包括：提供分块，每个分块包括同一混合物的一部分，所述混合物包含第一靶和第二靶、用于所述第一靶和所述第二靶的扩增的引物、对任一靶的扩增敏感的通用报告物和对所述第二靶的扩增特异地敏感的特异性报告物，其中只有所述分块的第一子集每个包含所述第一靶的至少一个拷贝，且所述分块的仅仅第二子集每个包含所述第二靶的至少一个拷贝，并且其中所述分块的第三子集每个包含所述第一靶的至少一个拷贝和所述第二靶的至少一个拷贝；扩增在所述分块中的所述第一靶和所述第二靶；从存在于多个所述分块中的所述通用报告物和所述特异性报告物收集扩增数据；以及基于所述扩增数据计算每个靶的水平；其中，所述第一靶和所述第二靶为核苷酸序列，并且使用所述扩增数据的簇计数的适当组合和排除来计算每个靶的水平。2.如权利要求1所述的方法，其中，在所述扩增数据中，所述第三子集的分块不能够与所述第一子集或所述第二子集的分块可靠地区分开。3.如权利要求1所述的方法，其中所述第三子集的所述分块有助于为所述第一靶和所述第二靶中的至少一个计算的水平。4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一靶和所述第二靶中的至少一个的水平的计算只使用选择性地排除所述第三子集的分块的、所述扩增数据的一部分被执行。5.如权利要求1所述的方法，其中，在相同的温度下从所述多个所述分块收集所有所述扩增数据。6.如权利要求1所述的方法，其中所述水平是浓度。7.如权利要求1所述的方法，还包括基于所述每个靶的水平确定所述第一靶和所述第二靶之一的拷贝数变化的步骤。8.如权利要求7所述的方法，其中，所提供的分块包含来自基因组的核酸，其中所述第一靶和所述第二靶中的一个是具有在所述基因组中的已知拷贝数的参考靶，并且所述第一靶和所述第二靶中的另一个是具有在所述基因组中的未知拷贝数的感兴趣靶。9.如权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含一组完整的试剂以支持每个靶的扩增。10.如权利要求1所述的方法，其中所述特异性报告物具有完整的形式和一个或多个降解的形式，其中所述一个或多个降解的形式在所述第二靶的扩增期间从所述完整的形式产生，并且其中，收集扩增数据的步骤包括从所述特异性报告物的所述一个或多个降解的形式收集数据。11.一种执行多重数字分析的方法，所述方法包括：提供分块，每个分块包括同一混合物的一部分，所述混合物包含第一靶和第二靶、用于所述第一靶和所述第二靶的扩增的引物、通用报告物和特异性报告物，其中所述分块的仅仅子集每个包含所述第一靶的至少一个拷贝，且所述分块的仅仅另一子集每个包含所述第二靶的至少一个拷贝，并且其中所述分块的子集每个包含所述第一靶的至少一个拷贝和所述第二靶的至少一个拷贝；扩增在所述分块中的所述第一靶和所述第二靶以产生相应于所述第一靶的第一扩增子和相应于所述第二靶的第二扩增子，其中所述通用报告物结合到所述第一扩增子和所述第二扩增子，并且其中所述特异性报告物结合到所述第二扩增子而不结合到所述第一扩增子；通过检测由所述通用报告物和所述特...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰·F·里根，斯维伦·S·特左内夫，雅恩·捷维诺，克劳迪亚·利特斯特，黛安娜·马尔，杰夫·麦克德莫特，
申请(专利权)人：伯乐生命医学产品有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US