本发明专利技术提供一种快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒,包括四重PCR反应体系,包含针对引起小儿细菌性肺炎四种临床难培养鉴定病原体:流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、嗜肺军团菌基因的正、反向引物和AllGlo荧光探针。本发明专利技术设计合理,可简便快速地在一个反应管中同时、平行地检测小儿细菌性肺炎四种临床难培养鉴定病原体的感染,实现了单管PCR同时检测四种细菌,且能够定量检测,操作简单快速,灵敏度高,特异性、重复性好,结果准确可靠,并可根据细菌感染的滴度,为小儿肺炎患者提供早期明确诊断和防治,对阻断传染源、减少四种细菌感染或混合感染、监测临床疗效均有很大的临床实用性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术,涉及一种快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量 PCR试剂盒,尤其涉及检测流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenzae, HI)、肺炎链球菌 (Streptococcus Pneumoniae, SP)、卡他莫拉菌(Moraxella Catarrhalis, MC)、嗜肺军团菌 (Legionella Pneumophila, LP)的四重定量PCR试剂盒,具体地说,本专利技术涉及应用四重 定量PCR技术在一个PCR反应管中快速、平行地同时检测四种细菌(HI、SP、MC、LP)的试剂 盒。
技术介绍
根据世界卫生组织(WHO)统计,肺炎是全球儿童的"头号杀手",也是5岁以下儿童 死亡的第二位原因。在我国,儿童肺炎亦是儿童期重要的常见疾病,在儿童患病率、病死率 中占据第一,用于治疗肺炎的巨大医疗费用加重了社会和患儿家庭的经济负担。近年来随 着抗生素、激素及免疫抑制剂的广泛应用,呼吸道防御功能及机体免疫力降低,人体寄生菌 与宿主之间的关系发生了变化,同时耐药菌的出现也进一步加重了疾病负担。 分析研究显示中国5岁以下死于肺炎的儿童中,感染肺炎链球菌和b型流感嗜血 杆菌的占到54. 2%。肺炎链球菌(SP)和流感嗜血杆菌(HI)常与正常菌群共生,是儿童社区 获得性肺炎的重要致病菌,通常起病急骤,以高热、寒战、咳嗽、血痰及胸痛为特征,主要经 呼吸道传播,好发于冬春季。卡他莫拉菌(MC)是引起儿童肺炎的第三位常见致病菌,仅次于 前两者,其发病率有逐年增加趋势,且令人担忧的是已发现产内酰胺酶菌株占分离菌 90%以上,给临床治疗带来困难。MC产生的内酰胺酶不仅保护着细菌产生的各种致病 性的酶,而且使得其他严重呼吸道合并感染如SP、HI感染对青霉素治疗无效。嗜肺军团菌 (LP)感染引起的肺炎,其临床表现多样,X线胸片改变缺乏特异性,可能合并肺外多脏器损 害。军团菌肺炎在非典型肺炎中是病情最严重的一种,未经有效治疗者的病死率高达45%。 以上四种细菌感染引起的肺炎,其症状、体征及X线检查结果不易鉴别和鉴定,因此快速同 步对小儿细菌性肺炎四种临床难鉴定病原体(!11、5?、1?:、1^)进行联合检测及鉴别诊断意义 重大。 细菌性肺炎的临床表现复杂多样、不典型,容易误诊和漏诊,为了早期明确病因诊 断,及早采取快速、有效的治疗,一个敏感而可靠的实验室诊断技术是必需的。HI、SP、MC、 LP感染引起的肺炎临床对其病原学诊断主要依靠细菌学检查。痰细菌培养仍是常规检测项 目,细菌培养阳性是诊断的金标准,具有一定的临床价值,但其生长缓慢、培养耗时长,技术 要求高,从临床样本中进行分离培养较困难并且难鉴定,易混淆而造成误诊,尤其在混合感 染中,可能会忽视一些潜在的病原菌,因而限制了其在临床的应用。另外,虽然血清学方法 技术成熟,有商品试剂盒供应,但是敏感性和特异性有待提高,同时,需要检测急性期和恢 复期双份血清才有诊断意义且容易漏诊。 定量PCR检测方法是目前众多研究的焦点,优点是快速简便、准确可靠、敏感性 高、特异性强、可以定量、不受抗生素应用的影响等。由此基础上发展而来的多重定量PCR 在儿童肺炎病原体联合检测及鉴别诊断中变得越来越重要。因此,迫切需要单管PCR同时 定量检测以上4种临床难培养鉴定细菌的感染或混合感染的试剂盒。其不仅快速准确、节 约成本,还可根据细菌感染的滴度,为小儿肺炎患者提供早期明确诊断和防治,为临床治疗 方案的制定提供参考依据,从而提高临床决策水平,有效降低抗生素的过度使用,监测临床 疗效,并最终改善患者预后。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足,提供一种快速联检四种难培养鉴定细菌 的多重定量PCR试剂盒,由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、1个阴性质控品、1个强阳性 质控品、1个弱阳性质控品、5个浓度的阳性定量标准品组成。其中四重荧光PCR反应液为 四组引物、探针以及qPCR反应缓冲液(含Mg2+)、四种dNTP、HotStartTaqDNA聚合酶等成 分构成的混合液。阴性质控品为灭菌注射用水。强、弱阳性质控品为由流感嗜血杆菌(HI)、 肺炎链球菌(SP)、卡他莫拉菌(MC)和嗜肺军团菌(LP)等量混合的阳性质粒样品,强阳性 质控品浓度l〇7Copies/y1,弱阳性质控品浓度103Copies/y1。5个阳性定量标准品是由 HI、SP、MC、LP等量混合的质粒样品,浓度分别为 103Copies/yl、104Copies/yl、105Copies/ y1、106Copies/y1、107Copies/y1。引物探针需要放置棕色瓶中避光。 所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列如下: HI: 上游引物:GATGCTGGTGTAITTGGTGG下游引物:CCGITCAACTTGGGCTTTAG 探针:SAT-AGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAG-SAT SP: 上游引物:CAITTGGTGATGCGGCTA下游引物:AGGACGGCTITCGITGAG 探针:MAR-CCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGT-MAR MC: 上游引物:ATCTATGCCAACTGGAAGCC下游引物:CCAACACGGAAATCACGAC 探针:JUP-CTATCGCCCACACACTCAGCGTG-JUP LP: 上游引物:TCGTCACTTAAACGGCTTC 下游引物:TACCGACCAGGAITGCTAC 探针:NEP-CGTACCGGCCTTGATATGAATTATG-NEP SAT、MAR、JUP、NEP是AllGlo探针的四种不同荧光素。 HI标准品序列: GATGCTGGTGTATTTGGTGGAAAAACTGACTTGAGTGCTATCAACTTAAATTTAAGTGGT GCTTATCGAGTAACAGAAGGTTTGAGCCTAGGTTTAGGGGTAAATGCGGTTTATGCTAAAGCCCAAGTTG AACGG SP标准品序列: CATTTGGTGA TGCGGCTAAA GGTAAAACAA TTGCAGCCGC ACAATACGCA GCCGGTGCAG ATATTGTTTA CCAAGTAGCT GGTGGTACAG GTGCAGGTGT CTTTGCAGAG GCAAAATCTC TCAACGAAAG CCGTCCT MC标准品序列: ATCTATGCCA ACTGGAAGCC TTATGGCAAT GATAAGGTGA ATGTAAACTT TGCGGTGAAT AATGTCTTTA ATAAAAACTA TCGCCCACAC ACTCAGCGTG CTTCCATAGA TACCTTACCT GGGGCAGGTC GTGATTTCCG TGTTGG LP标准品序列: TCGTCACTTA AACGGCTTCT TTCTAGATAA CTTCAATTCC AAATTCAATG GATTTGGTCC CCGTACCGGC CTTGATATGA ATTATGTATT CGGTAATGGG TTTGGTATTT ATGCAAAATC AGCTGTAGCA ATCCTGGTCG GT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒,其特征在于:由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、1个阴性质控品、1个强阳性质控品、1个弱阳性质控品、5个浓度的阳性定量标准品组成,其中四重荧光PCR反应液为四组引物、探针以及含Mg2+的qPCR反应缓冲液、四种dNTP、Hot Start Taq DNA聚合酶构成的混合液,强阳性质控品浓度107Copies/μl,弱阳性质控品浓度103Copies/μl; 所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列如下:HI:上游引物:GATGCTGGTGTATTTGGTGG下游引物:CCGTTCAACTTGGGCTTTAG探针:SAT‑AGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAG‑SATSP:上游引物:CATTTGGTGATGCGGCTA下游引物:AGGACGGCTTTCGTTGAG探针:MAR‑CCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGT‑MARMC:上游引物:ATCTATGCCAACTGGAAGCC下游引物:CCAACACGGAAATCACGAC探针:JUP‑CTATCGCCCACACACTCAGCGTG‑JUPLP:上游引物:TCGTCACTTAAACGGCTTC下游引物:TACCGACCAGGATTGCTAC探针:NEP‑CGTACCGGCCTTGATATGAATTATG‑NEPSAT、MAR、JUP、NEP是AllGlo探针的四种不同荧光素;HI标准品序列:GATGCTGGTG TATTTGGTGG AAAAACTGAC TTGAGTGCTA TCAACTTAAA TTTAAGTGGT GCTTATCGAG TAACAGAAGG TTTGAGCCTA GGTTTAGGGG TAAATGCGGT TTATGCTAAA GCCCAAGTTG AACGGSP标准品序列:CATTTGGTGA TGCGGCTAAA GGTAAAACAA TTGCAGCCGC ACAATACGCA GCCGGTGCAG ATATTGTTTA CCAAGTAGCT GGTGGTACAG GTGCAGGTGT CTTTGCAGAG GCAAAATCTC TCAACGAAAG CCGTCCTMC标准品序列:ATCTATGCCA ACTGGAAGCC TTATGGCAAT GATAAGGTGA ATGTAAACTT TGCGGTGAAT AATGTCTTTA ATAAAAACTA TCGCCCACAC ACTCAGCGTG CTTCCATAGA TACCTTACCT GGGGCAGGTC GTGATTTCCG TGTTGGLP标准品序列:TCGTCACTTA AACGGCTTCT TTCTAGATAA CTTCAATTCC AAATTCAATG GATTTGGTCC CCGTACCGGC CTTGATATGA ATTATGTATT CGGTAATGGG TTTGGTATTT ATGCAAAATC AGCTGTAGCA ATCCTGGTCG GTA。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:余道军,陈懿,何慧,
申请(专利权)人:杭州市第一人民医院,
类型:发明
国别省市:浙江;33
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