一种棉花亮氨酸拉链蛋白bZIP-2及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种来源于棉花的亮氨酸拉链蛋白bZIP-2及其编码基因，以及所述基因在培育抗旱性提高的转基因植物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种棉花亮氨酸拉链蛋白bZIP-2及其编码基因与应用
本专利技术涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的亮氨酸拉链蛋白bZIP-2及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。
技术介绍
温度、盐渍和干旱等逆境胁迫会对高等植物的生长发育造成严重危害，导致作物产量降低，品质下降，严重威胁农业生产和自然环境。其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计，世界干旱、半干旱地区占陆地面积的34％；我国干旱、半干旱地区约占国土面积的52％，年受旱面积达200-270万公顷，全国灌溉区每年缺水约30亿立方米，因缺水而少收粮食350-400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。植物耐旱性大多属于多基因控制的数量性状，利用常规育种方法改良作物的抗旱性受到周期长、优质种质资源缺乏的限制。近年来的转录组学、蛋白组学和基因表达调控的研究初步揭示了植物干旱胁迫的作用分子机理。目前，利用干旱胁迫相关基因提高植物的抗旱能力，已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。植物受到逆境胁迫时会产生相应的应答反应，以降低或消除逆境胁迫给植物带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径及多基因产物的复杂过程。但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境的生物化学和生理学响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将为植物抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基础。
技术实现思路
本专利技术人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆了棉花的一个亮氨酸拉链蛋白(本文命名为bZIP-2)的编码基因，并测定了其DNA序列。并且发现将其导入受体植物并超量表达后，可显著改善转基因植株的耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。本专利技术第一方面提供棉花的一个亮氨酸拉链蛋bZIP-2的编码基因(本文命名为GhbZIP-2)，其序列为SEQIDNO：2。本专利技术第二方面提供一种重组表达载体，其含有本专利技术第一方面所述的基因，其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的，优选地，所述表达载体是pCAMBIA2300；并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述重组表达载体为附图2所示的35S-GhbZIP-2-2300载体。本专利技术第三方面提供一种重组细胞，其含有本专利技术第一方面所述的基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。本专利技术第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法，包括：将本专利技术第一方面所述的基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本专利技术第一方面所述的基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第六方面提供本专利技术第一方面所述的基因、本专利技术第二方面所述的重组表达载体或者本专利技术第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第七方面提供由本专利技术第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。附图说明图1是GhbZIP-2基因的植物表达载体(35S-GhbZIP-2-2300)的构建流程(图1a-1b)。图2是GhbZIP-2基因的植物表达载体(35S-GhbZIP-2-2300)的质粒图。图3是GhbZIP-2基因的T2代转基因拟南芥植株(图中，T2E3；T2E5)和作为对照的非转基因拟南芥植株(图中，CK1、CK2)的耐旱模拟实验结果。(图3a为正常生长20天的拟南芥植株；图3b为正常生长20天后干旱处理14天的拟南芥植株)。图4是利用反转录PCR对T2代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中GhbZIP-2基因在转录水平上的分子检测验证结果。M为DNALadderMarker(DL2000，TakaRa)，1-4为非转基因的对照拟南芥植株，5-8为耐旱效果不显著的转基因拟南芥T2代植株，9-16为耐旱效果显著的转基因拟南芥T2代植株(依次为株系：T2E1、T2E2、T2E3、T2E4、T2E5、T2E6、T2E7、T2E8)具体实施方式下面结合非限制性实施例对本专利技术进行进一步说明。下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自NewEnglandBiolabs公司。实施例1、干旱胁迫下棉花SSH文库构建：具体方法为：按照Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建SSH文库(差减文库)。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片的mRNA作为样本(TestermRNA)，以未处理的棉花幼苗的叶片的mRNA作为对照(DrivermRNA)。具体步骤如下：(1)供试材料：冀棉14(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-30270)播种到灭过菌的蛭石上，在25℃、光周期16h光照/8h黑暗(光强2000-3000Lx)条件下培养，每周浇1/2MS液体培养基(含9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。当苗株高达25-30cm时用于实验。(2)材料处理：将上述供试幼苗分为2组，每组4盆，每盆1株。第一组为对照组，在25℃、光周期16h光照/8h黑暗条件下培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组，25℃、光周期16h光照/8h黑暗条件下培养，停止浇灌，处理10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。(3)总RNA提取：分别取对照组和干旱处理组的棉花叶片各0.5g，用植物RNA提取试剂盒(购自Invitrogen)提取棉花叶片的总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定所得总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高；用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA纯化试剂盒(purificationofpolyA+RNAfromtotalRNA)分离mRNA。(4)抑制差减杂交：按Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒说明书所示的方法进行抑制差减杂交。先将DrivermRNA和TestermRNA分别反转录，得到双链cDNA，再以2μgTestercDNA和2μgDrivercDNA作为起始材料进行差减杂交。在37℃水浴下分别将Teste本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.棉花的一个亮氨酸拉链蛋白，其序列为SEQIDNO：1。2.编码权利要求1的亮氨酸拉链蛋白的基因，其序列为SEQIDNO：2。3.一种重组表达载体，其是通过将权利要求2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；所述表达载体是pCAMBIA2300。4.一种重组细胞，其含有权利要求2所述的基因或者权利要求3所述的重组表达载体；所述重组细胞为重组农杆菌细胞。5.一种改善植物耐旱性的方法，包括：将权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文华，孙超，崔洪志，
申请(专利权)人：创世纪种业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44