本发明专利技术公开了一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白序列、制备工艺及其应用。该尿酸酶蛋白简称为JBUO，源自狒狒尿酸酶蛋白序列，并进行了人源化的突变和增强活性的突变，使其同时具有免疫原性低和催化活性高的特点。将JBUO密码子优化后，克隆到原核表达载体中，转化大肠杆菌，收获重组蛋白量可达10mg/每克干菌，同时JBUO的生物学活性大于6 IU/mg。本发明专利技术可高效、快速的获得与人体高度同源的低免疫原性的新型尿酸酶纯品，广泛用于制备治疗与人体高尿酸相关疾病的药物、食品等产品，具有极高的使用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药
，具体涉及一种基于狒狒尿酸酶进行改造后与人体高度同源且生物学活性很高的尿酸酶嵌合蛋白及其作为制备治疗痛风或者高尿酸血症的药物中的应用。
技术介绍
痛风和高尿酸血症是目前危害人类健康的常见疾病，据统计高尿酸血症的发病率已经达到了人群的10%。痛风是由于血尿酸水平过高而造成尿酸盐结晶在关节中沉积而导致的一种急性关节炎。尿酸是人体在代谢嘌呤过程中的产物，嘌呤代谢障碍会导致尿酸积累过量，引起血液中尿酸浓度增高，引发高尿酸症。长期尿酸过高极易引发痛风，并增加多种心脑血管疾病的发病风险，包括动脉粥样硬化、高血压、脑卒、糖尿病等。此外，恶性肿瘤的患者在化疗过程中，大量细胞的死亡溶解会带来肿瘤溶解综合症TLS，最主要的症状就是高尿酸血症，并极易引发肾衰竭。目前，控制痛风和治疗尿酸过高的药物都有诸多缺陷。秋水仙碱可以抑制痛风发作时的急性炎症反应，但是毒性巨大，且不能降低尿酸含量。丙磺舒、苯溴马隆等药物可以干扰肾小管对尿酸的重吸收，促进尿酸的排泄，但是对人体肾脏的损伤巨大，容易引发肾结石等肾病的发生。吲哚美辛等非留体抗炎药可以缓解改善痛风引发的关节炎等症状，消除疼痛，但是无法长期服用，副作用巨大。别嘌呤醇等药物通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，阻断尿酸的产生来降低尿酸，但是又增加了肾脏排泄尿酸前体的负荷，而且容易引发黄嘌呤肾病和结石。目前，高尿酸血症已被列为心血管疾病的独立风险因素。因此，寻找有效的治疗手段势在必行。在动物体内，其尿酸的水平仅为人类的1/10。因此痛风和高尿酸血症也被认为是人类独有的疾病。动物体内尿酸水平低的原因是由于其体内存在有能够把尿酸进一步分解为极易溶解的尿囊素的尿酸酶。通过对比发现，人类的基因组中也存在尿酸酶基因，但是在人类进化的过程中，由于该基因的突变，造成其不能表达有功能的蛋白质，从而成为一个假基因。由此可见尿酸酶是治疗痛风与高尿酸血症的理想药物。与上述药物相比，尿酸氧化酶UOX针对的直接药物靶点就是尿酸，能够快速降低人体血液中的尿酸浓度，而且还能催化肾脏和关节中的尿酸沉淀快速分解，能从根本上治疗高尿酸血症，副作用极低。尿酸氧化酶UOX是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶，能高效氧化尿酸成为尿囊素和过氧化氢。UOX分子是同源四聚体，每个蛋白亚基含有301个氨基酸，单亚基分子量为34kDa。UOX的每个亚基由两个相同的结构域组成，被称为T-折叠结构域。UOX的4个亚基通过复杂的氢键网络形成非共价连接，组成对称的四聚体蛋白。只有四聚体的UOX才具有生物酶活性。在目前所知的所有来源的尿酸酶中，活性最高的来源于黄曲霉，达到27IU/mg ;其次是来源于苛求芽胞杆菌，它的活性保持在13 IU/mg。；来源于哺乳动物的尿酸酶，经过重组表达以后，猪的尿酸酶活性可以达到5IU/mg，狒狒的尿酸酶酶活性只有IIU/mg,而人源尿酸酶无活性。要想将尿酸酶应用于人体，需要兼顾微生物尿酸酶的高活性和哺乳动物尿酸酶的低免疫原性才行。目前，黄曲霉来源的尿酸酶(Uricozyme)在法国和意大利已批准，但其序列与推测出的人源尿酸酶的同源性不足40% ;基因重组的酵母菌尿酸酶(Rasburicase)在美国和欧盟或批准。由于这两种尿酸酶均来自于细菌，有很强的免疫原性，Uricozyme和Rasburicase在使用中出现严重过敏反应的比例达5%以上，并且还有近半数的患者出现发热，恶心呕吐等不良反应。目前在美国用于临床的尿酸酶蛋白(Pegloticase)是经过PEG化修饰的猪的重组尿酸酶嵌合蛋白，商品名为KRYSTEXXA。但由于与人类的差异造成的排异反应，加之PEG化的影响，其免疫原性仍然较强。每两周一次静脉注射KRYSTEXXA的患者中92%产生了抗pegloticase的抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是进一步改善重组尿酸酶的免疫原性，选择与人类更为接近的狒狒作为尿酸酶基因的来源，并且基于结构生物学和蛋白酶学的方法，对其进行了提高酶活的突变改造，从而获得了与人体尿酸酶高度同源但是具有高酶活的人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白，对于痛风和高尿酸症的防治具有重要的应用价值。本专利技术包括此新型嵌合尿酸酶JBUO的优化基因序列，蛋白质序列，重组表达载体的构建方法，嵌合尿酸酶的提纯工艺，性质鉴定和活性标定等。本专利技术是采用如下技术方案实现的: 一、重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO的序列设计 狒狒体内的尿酸酶(Pap1 hamadryas Urate Oxidase，简写为PU0)与推测出人体的尿酸酶(predicted Human Urate Oxidase，简写为pHUO)序列高度相似，同一性为95.4%，远高于猪源的尿酸酶(86.6%)，鼠源的尿酸酶(85.2%) (Rattus norvegicus Urate Oxidase,简写为 RU0)和犬源的尿酸酶(88.2%) (Canis lupus familiaris Urate Oxidase，简写为CU0)。因此，本申请人基于狒狒尿酸酶PUO进行突变改造，可以极大程度的降低人体中重组蛋白的免疫原性。然而，狒狒体内的尿酸酶活性不高(约?υ/mg)，比其它哺乳动物来源的尿酸酶都低(猪尿酸酶5 U/mg，犬尿酸酶7 U/ml)。因此，如何通过替换提高酶催化活性的尿酸酶氨基酸序列，显著提高狒狒尿酸酶PUO的催化活性，就是本专利技术的主要目的。本专利技术人经过长期系统的研究，特别是结合尿酸酶四聚体复合物的晶体结构进行分析，发现进行特定位点的氨基酸替换，可以形成特定形式的重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBU0，其氨基酸序列如下: MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPffKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQMKSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKffRYHQGRDVDFEATffDTVRDIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRLο该重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO与人源尿酸酶pHUO氨基酸序列相似性很高(94.8%)，而且活性显著提升(大于6U/mg)，同时兼顾了免疫原性低和活性高两大难题，具有极其重要的应用价值。进一步的，JBUO的序列来自于狒狒尿酸酶PUO序列，由304个氨基酸组成。如图I所示，与天然的PUO相比，突变位点包括以下12个:D3H，N7D，G91A，V92M，Y97H，I105V，L120F，L146M，R147K，C202G，G212D，E220K。其中部分位点的突变是为了增强尿酸酶催化活性，其它位点的突变是为了进一步减少免疫原性。二、重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白JBUO的重组表达 重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白对应的核苷酸序列插入原核表达载体或者真核表达载体进行表达。优选的，将该蛋白对应的核苷酸序列插入大肠杆菌表达载体进行表达，用ρΗΙ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白，其特征在于：氨基酸序列如下：MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQMKSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨霞，
申请(专利权)人：山西锦波生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山西;14
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