一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法，由提取菌种、感染、取材、悬液制备、扩大培养、计数、灭活、合成、稀释、分装、检验十一个步骤组成，所制备的斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗由爱德华氏菌，再加入适量双抗及防腐剂组成，本发明专利技术成本低廉，操作方便，可有效提高斑点叉尾鮰免疫力，防治斑点叉尾鮰爱德华氏菌病发生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水产养殖病害防治领域，具体涉及一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗 的制备方法。
技术介绍
斑点叉尾鮰（IctalurusPunctatus (Raf inesque)亦称沟舱（ChannelCatf ish)，属 于鲶形目（Siluriformes)、鮰科（Ictaluridae)鱼类。具有食性杂、生长快、适应性广、易 饲养、易起捕以及肉质上乘等优点，是世界闻名的养殖品种和游钓对象。斑点叉尾鮰含肉率 高，而且营养丰富，据测定，含肉率为75. 71 % ;肌肉中粗蛋白占19. 42%，脂肪占1. 01 %，水 分占77. 58%，灰分占1. 12%，碳水化合物占0. 87% ;肌肉中含有18种氨基酸，占肌肉总量 的18. 72%，其中人体必需氨基酸占总氨基酸的42. 26%。矿物质含量中Fe、Zn的含量较 高，而对人体健康有害的物质如Pb、As等的含量很低。因此，斑点叉尾鮰历来深受东南亚各 国和港、澳市场的欢迎，是我国外贸出口的重要水产品之一。当前随着斑点叉尾鮰养殖规模 的扩大，集约化养殖程度的提高，其病害的危害也越来越大，其危害程度有加剧趋势，其常 见病有：水霉病、腐皮病、出血性腐败症、爱德华氏菌病、柱状病、小瓜虫病、鱼波豆虫病等， 特别是斑点叉尾鮰爱德华氏菌病传染性强，发病率高、死亡率最高，可造成鱼种、成鱼大量 死亡，给养殖户造成较大经济损失。其病原体是爱德华氏菌（Edwardsiella tarda)，是该菌 广泛分布于自然界，菌体短杆状，具周鞭毛，有动力，革兰氏染色阴性。当皮肤受伤可使病原 菌侵入机体而发病，引起外伤的主要原因有捕捞损伤和寄生虫寄生损伤等。 近几年来，国产、进口的药物对斑点叉尾鮰爱德华氏菌病均无明显疗效或成本太 高，效果不明显。只能通过免疫的途径进行预防，而这种疫苗目前在还是空白。
技术实现思路
本专利技术提供了，本专利技术成本低廉， 操作方便，可有效提高斑点叉尾鮰免疫力，防治斑点叉尾鮰爱德华氏菌病发生。 本专利技术是通过下面的技术方案来实现的。 -种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下： (1)、提取菌种：从患有明显爱德华氏菌病症状的斑点叉尾鮰肝脏、肾脏、血液、腹 水中分离出病原菌爱德华氏菌，立即放入4-8°C的冰箱中保存； (2)、感染：将分离的病原菌接种于健康的斑点叉尾鮰体内，在室内进行感染试验， 每只斑点叉尾鮰接种的病原菌数为1-2X10 9个，检查是否有毒力，证明确有毒力才用作制 疫苗材料； (3)、取材：取上述斑点叉尾鮰发病组织材料，称重，每克组织材料中加0. 85%生 理盐水10毫升，用研钵或匀浆器进行匀浆，制成10%浓度的组织悬液，将制得的组织悬液 直接置于-30°C~-40°c低温冰箱中保存，或者向制得的组织悬液中按10%加入50%的磷 酸缓冲甘油，将其置4-8 °C的冰箱中保存。 (4)、悬液制备：将步骤（3)分离出的致病菌爱德华氏菌接种在普通琼脂营养基或 肉汤培养基内，培养24-48小时，加入少量生理盐水，用接种环将菌苔刮下，充分振荡，制成 细菌分布均匀的悬液； (5)、扩大培养：取单个菌落在25-30°C条件下培养48-72小时，振荡使培养斜面上 的菌落洗下，或用灭菌接种环轻轻刮下，进行灭活处理； (6)、灭活：将扩大培养结束的爱德华氏菌悬液摇匀，放入60-70 °C恒温水浴 1. 5-2. 5小时灭活或32°C恒温水浴中70-73小时灭活，即制成灭活疫苗；(7)、合成：将灭活后的菌液置于高速离心机中，用3000转/分离心机离心30-40 分钟，分离出上清液，向分离出的上清液中添加一定量得青霉素、链霉素和浓度为10%的福 尔马林溶液，并摇匀，其中，每10毫升上清液中加入青霉素8000单位、链霉素8000单位， 10 %浓度的福尔马林溶液0. 1毫升； (8)、稀释：用0.85%的无菌盐水稀释灭活菌液至浓度为5父10 9(^11/1111;(9)、分装：将稀释后的灭活菌液，置于4_8°C冰箱中保存备用； (10)、检验：对上述稀释好的灭活菌液进行无菌、安全及免疫效果三项检验，要求， 灭活菌液中没有活菌存在，灭活细菌的安全的系数要达到100%，免疫保护率达到80%以 上；(11)、检验合格后的灭活菌液，继续置于4_8°C冰箱中保存备用。 步骤（7)合成时，每10毫升上清液中加入青霉素8000单位、链霉素8000单位， 10%浓度的福尔马林溶液0. 1毫升。 步骤（10)所述的无菌检验方法具体操作是：提取0. 2ml灭活菌样本接种在普通营 养琼脂培养基上，在25-28°C条件下培养48小时，观察是否形成菌落，若形成菌落则说明疫 苗含菌，必须重新灭活，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中 确实没有活菌存在。 步骤（10)所述的安全检验方法具体操作是：对当年健康斑点叉尾鮰鱼种进行腹 腔注射，每尾注射0. 3-0. 5毫升，在水温25-28°C的水缸中饲养，经15d观察无发病或死亡说 明该灭活细菌是安全的，必须做到100 %安全才可使用。 步骤（10)所述的免疫效果检验方法具体操作是：在给健康斑点叉尾鮰接种上述 制备的疫苗，二周后进行攻毒，观察免疫保护率，具体操作方法是取上述疫苗，每尾斑点叉 尾鮰注射疫苗量为〇. 3-0. 5ml，每天观察斑点叉尾鮰的发病及症状等情况并做好记录，另外 用新鲜的或甘油保存的病鱼组织制成的未经灭活处理的浓度为10%的组织悬液，分别注射 到已注射过疫苗的斑点叉尾鮰和没有注射过疫苗的斑点叉尾鮰体内进行对照，每尾按0. 5 毫升进行腹腔注射，继续观察15天，如果对照组全部发生爱德华氏菌病，死亡率在70%以 上，病斑点叉尾鮰症状与天然发病的症状一样或相似，而免疫组仍健康存活，免疫保护率在 80%以上，证明此疫苗有效。 免疫方法： 1、注射法。 ①注射部位：一般通过肌注或腹腔注射进行免疫，这样操作用量较均，避免浪费。 ②注射时间：一般在放养鱼种阶段进行。 ③注射剂量：注射一次见效，注射剂量：鱼苗为〇. 3-0. 5毫升/尾，成鱼为2毫升/ 公斤，每毫升疫苗中含有50亿菌， 2、口服方法三天为一个疗程，鱼苗第一天用量为100毫升/公斤饲料，第二、三天 减半；成鱼第一天用量为150毫升/公斤饲料，第二天为100毫升/公斤饲料，第三天为50 毫升/公斤饲料。在菌苗拌入饲料时，要搅拌均匀，同时菌苗要在投喂前1-4小时拌入饲料， 不宜过早，切忌过夜，以免菌苗变质，一般拌有菌苗的饲料为平时每日投喂量的1/5或2/5， 等拌有菌苗的饲料吃完后再投放其余饲料。 3、浸浴免疫适用于大批鱼群的免疫，目前在国内应用于生产性鱼池的浸浴免疫方 法有：疫苗加莨菪碱法，即用0. 5%浓度下充氧浸浴3小时。 本专利技术的有益效果： 本专利技术方法制备的斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗，具有成本低廉，操作方便，可有 效提高斑点叉尾鮰免疫力，对斑点叉尾鮰保护率可以达到80%以上，且防治效果显著，操作 方便，易于实现，无任何副作用，可给斑点叉尾鮰养殖户带来巨大的经济效益和社会效益。【具体实施方式】 斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法，具体操作步骤如下： 1、提取菌种：从患有明显爱德华氏菌病症状的斑点叉尾鮰肝脏、肾脏、血液、腹水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）、提取菌种：从患有明显爱德华氏菌病症状的斑点叉尾鮰肝脏、肾脏、血液、腹水中分离出病原菌爱德华氏菌，立即放入4‑8℃的冰箱中保存；（2）、感染：将分离的病原菌接种于健康的斑点叉尾鮰体内，在室内进行感染试验，每尾斑点叉尾鮰接种的病原菌数为1×109‑2×109个 ，检查是否有毒力，证明确有毒力才用作制疫苗材料；将分离的病原菌倒入灭菌空试管中，用无菌生理盐水稀释调节菌浓度，与麦氏比浊管进行比色，使菌浓度达到5×109cfu/ml；（3）、取材：取上述斑点叉尾鮰发病组织材料，称重，每克组织材料中加0.85%生理盐水10毫升，用研钵或匀浆器进行匀浆，制成10%浓度的组织悬液，将制得的组织悬液直接置于‑30℃～‑40℃低温冰箱中保存，或者向制得的组织悬液中按10%加入50%的磷酸缓冲甘油，将其置4‑8℃的冰箱中保存；  （4）、悬液制备：将步骤（3）分离出的致病菌爱德华氏菌接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基内，培养24‑48小时，加入少量生理盐水，用接种环将菌苔刮下，充分振荡，制成细菌分布均匀的悬液； （5）、扩大培养：取单个菌落在25‑30℃条件下培养48‑72小时，振荡使培养斜面上的菌落洗下，或用灭菌接种环轻轻刮下，进行灭活处理； （6）、灭活：将扩大培养结束的爱德华氏菌悬液摇匀，放入60‑70℃恒温水浴1.5‑2.5小时灭活或32℃恒温水浴中70‑73小时灭活，即制成灭活疫苗； （7）、合成：将灭活后的菌液置于高速离心机中，用3000转/分离心机离心30‑40分钟，分离出上清液，向分离出的上清液中添加一定量的青霉素、链霉素和浓度为10％ 的福尔马林溶液，并摇匀； （8）、稀释：用0.85％的无菌盐水稀释灭活菌液至浓度为5×109cfu/ml； （9）、分装：将稀释后的灭活菌液，置于4‑8℃冰箱中保存备用；（10）、检验：对上述稀释好的灭活菌液进行无菌、安全及免疫效果三项检验，要求，灭活菌液中没有活菌存在，灭活细菌的安全的系数要达到100%，免疫保护率达到80%以上；（11）、检验合格后的灭活菌液，继续置于4‑8℃冰箱中保存备用， 步骤（10）所述的无菌检验方法具体操作是：提取 0.2ml 灭活菌样本接种在普通营养琼脂培养基上，在25‑28℃条件下培养48小时，观察是否形成菌落，若形成菌落则说明疫苗含菌，必须重新灭活，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在；步骤（10）所述的安全检验方法具体操作是：对当年健康斑点叉尾鮰鱼种进行腹腔注射，每尾注射0.3‑0.5毫升，在水温25‑28℃的水缸中饲养，经 15d 观察无发病或死亡说明该灭活细菌是安全的，必须做到100%安全才可使用；步骤（10）所述的免疫效果检验方法具体操作是：在给健康斑点叉尾鮰接种上述制备的疫苗，二周后进行攻毒，观察免疫保护率，具体操作方法是取上述疫苗，每尾斑点叉尾鮰注射疫苗量为0.3‑0.5 ml ，每天观察斑点叉尾鮰的发病及症状等情况并做好记录，另外用新鲜的或甘油保存的病鱼组织制成的未经灭活处理的浓度为10%的悬液，分别注射到已注射过疫苗的斑点叉尾鮰和没有注射过疫苗的斑点叉尾鮰体内进行对照，每尾按0.3‑0.5毫升进行腹腔注射，继续观察15天，如果对照组全部发生爱德华氏菌病，死亡率在70％以上，病斑点叉尾鮰症状与天然发病的症状一样或相似，而免疫组仍健康存活，免疫保护率在80%以上，证明此疫苗有效。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李进村，许军，曹明远，刘其芝，王应琴，
申请(专利权)人：霍邱县绿波水产科技服务有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34