本发明专利技术提供了一种用于外周血循环肿瘤细胞的一次性分离芯片模块及其使用方法。所述模块包括微流控芯片、血液样本储液池、PBS样本储液池、废液储液池、富集回收液出口、微流控芯片与血液样本储液池的连接导管、微流控芯片与PBS样本储液池的连接导管、微流控芯片与废液储液池的连接导管以及微流控芯片与富集回收液出口的连接导管。本发明专利技术还包括该模块的使用方法。本发明专利技术所述微流控芯片采用双入口和双出口结构，其去除红细胞的效率可达到100%，临床血液样本无需稀释或裂解红细胞的前处理过程，可以节省大量的分离操作时间，有效保障分离富集后循环肿瘤细胞的活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤检测
，特别是涉及。
技术介绍
循环肿瘤细胞(CTCs)是从肿瘤原发病灶或转移病灶进入外周血的肿瘤细胞，检测循环肿瘤细胞对癌症防治有重要意义，可有效地应用于体外早期诊断、化疗药物的快速评估、个体化治疗等。对于肿瘤的常规检测手段来讲，例如影像学，肿瘤在小于一公分的情况下，很难确认其为异常。通过国内外研究可以看到，很多肿瘤在2-4毫米的情况下已经有肿瘤细胞进入血液循环，从这个角度讲，它对于早期诊断来讲有不可低估的意义。血清肿瘤标志物检测法的优点是可为影像学诊断提供参考数据、费用低廉和适用于大众筛查，缺点是没有高度特异性的标志物，常出现假阳性和假阴性结果；组织病理学检测的优点是利于确诊，缺点是有创性检查、不能用于检测和对于转移的信息不完全。相比以上传统方法，循环肿瘤细胞检测法的优点是非浸入性、敏感性高、好的转移指标、化疗和放疗效果的快速评估、预后评估、检测复发、费用低和适用于大众筛查，因此循环肿瘤细胞检测法在临床肿瘤防治领域具有广阔的应用前景。经美国FDA认证的易莫尼康(Immunicon)公司通过多年的科研，在几百个病人身上做了大量的科学研究，最终得出结论，在治疗后通过检测循环肿瘤细胞的个数，可以明确的确定病人其预后情况。目前，只有美国Immunicon公司研发的CellSearch?系统成为一个标准实验方案，于2004年被美国食品药品管理局(FDA)准入临床应用。这是一项汇集了免疫磁性分选技术和免疫细胞化学法的分选检测技术，通过在磁珠上固定EpCAM抗体而特异性地识别、结合靶细胞，在外加磁场的作用下完成肿瘤细胞的筛选。但该方法的缺点是操作复杂，需要多步完成，对于有些处于间叶期的循环肿瘤细胞，其EpCAM表面抗原表达非常低甚至不表达，因此该方法很难检测到这一类循环肿瘤细胞的存在。确定性侧向位移(DLD)是指在微柱阵列中超过临界半径的大体积物质碰撞后发生侧向位移向一侧汇聚，小体积物质按照其原流向流过阵列的现象。基于CTCs细胞尺寸(12?30 μπι)与血细胞尺寸(5?15 μπι)差异的物理特性，可设计制作分选富集临界半径介于CTCs与血细胞间的DLD阵列微流控芯片。杜晶辉等人(杜晶辉，刘宗彬，张望等.快速分选富集循环肿瘤细胞的微流控芯片.中国卫生检验杂志，2013年06期.)建立三角形微柱确定性侧向位移阵列微流控芯片，芯片由一个流道进口、中央富集流道出口、两侧非富集流道出口及镜像对称的三角形微柱陈列构成，三角形微柱DLD阵列微流控芯片可实现2ml/min、95%高回收率对外周血肿瘤细胞分选。由于该研究采用单入口芯片，难以实现高回收率，而且血液是需要进行十倍体积稀释的，分离时间会大大延长；稀释的血液通入到芯片后，红细胞和白细胞是均匀分布在整个芯片中的，所以红细胞从富集液收集口出来的比例与血液的稀释比例是一样的，最后得到的收集液里面红细胞的浓度是和血液稀释的浓度相同。富集液中含有红细胞对观察会造成很大的影响，影响循环肿瘤细胞的纯度，进而对循环肿瘤细胞进行分析研究造成不利影响。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的上述缺陷，提供，能够实现对外周血中的循环肿瘤细胞进行快速、精确、高活性的分离富集。本专利技术采用如下的技术方案:用于外周血循环肿瘤细胞的一次性分离芯片模块，包括微流控芯片、血液样本储液池、PBS (磷酸盐缓冲液)样本储液池、废液储液池、富集回收液出口、微流控芯片与血液样本储液池的连接导管、微流控芯片与PBS样本储液池的连接导管、微流控芯片与废液储液池的连接导管以及微流控芯片与富集回收液出口的连接导管； 所述微流控芯片基于确定性侧向位移阵列原理的设计。优选地，所述微流控芯片的宽度为3-5mm，长度为5_7cm ;微流控芯片的临界半径为 6.5-8.5 μ m。优选地，所述微流控芯片的宽度为4mm，长度为6cm。优选地，所述微流控芯片包括一供血液流通的管道和多个结构单元，所述管道的中线与流体方向平行，所述结构单元是截面形状为正三角形的微柱，所述微柱以所述管道的中线为中心轴呈角度对称排列。优选地，所述三角形微柱的三角形有一条边与流体的方向垂直。优选地，微流控芯片流道高度为30-100 μm ;正三角形的边长为20_40 μπι。优选地，微流控芯片流道高度为75 μm ;正三角形的边长为30 μπι。优选地，所述微柱分为多行，同一行相邻微柱的间距在X轴的投影为30-50 μπι，相邻两行微柱的间距在I轴的投影为45-70 μ m，其中X轴与所述管道的中线平行。优选地，同一行相邻微柱的间距在X轴的投影为40 μm，相邻两行微柱的间距在y轴的投影为58 μπι。优选地，所述微柱阵列的倾斜角为1-5度。优选地，所述微柱阵列的倾斜角为3.1度。优选地，所述微流控芯片采用双入口结构，分别是血液样本入口和PBS缓冲液入□ O血液和PBS缓冲液分别从血液样本入口和PBS缓冲液入口进入微流控芯片，流入微流控芯片区域相遇后会形成三股流体区域，两侧为血液流体区域，中间为PBS缓冲液流体区域，形成这种现象的原因是因为流体在层流的状态下流体之间不会发生混合，所以只有大于微流控芯片临界尺寸的细胞才会从血液流体区域流入PBS缓冲液流体区域，而红细胞是一种偏平状的细胞，不管是直径还是宽度都比临界尺寸要小，所以只会在红细胞流经区域，因此，本专利技术的一次性分离芯片模块去除红细胞的效率可达到100%。优选地，所述微流控芯片采用双出口液体收集结构，分别是中间流道口和芯片两侧连接后的出口，分离得到的富集液从中间流道的富集回收液出口流出，废液则从芯片两侧连接后的废液口流出。—次性分离芯片模块使用的材料为COC塑料，其中基板是由两层COC薄板组成，采用注塑成型的加工方法得到一块带有联通管道和与外界连接出口的COC薄板，然后与另一块表面平整的COC薄板经热键合方式封接成型，基板内部是有管道联通各个储液池与微流控芯片接口连接。本专利技术的使用方法如下: (1)将待测血样和PBS缓冲液分别加入血液样本储液池和PBS样本储液池，富集回收液出口放置1.5ml无菌离心管接收富集回收液； (2)将一次性分离芯片模块放入分离仪的模块嵌入口，气压控制接口分别与血液样本储液池和PBS样本储液池对接密封； (3)开启仪器，微流控芯片开始处理血液，根据细胞直径的大小实现循环肿瘤细胞的富集分离，富集分离液从富集分离出口流出并接入1.5ml无菌离心管中，分离后的废液会储存在废液储液池中。优选地，采用气压进样控制血液样本和PBS缓冲液通入微流控芯片的方式，入口压力为 1000-2000mbars。将H1299细胞加入到磷酸盐缓冲溶液或者正常人血液中模拟癌症病人的血液，检测结果显示:约100%的H1299细胞被富集分离，分离后的H1299细胞浓度较分离前提高了50倍，检测速度达到2毫升每分钟。本专利技术的有益效果是:采用双入口流体设计的微流控芯片，相比只有血液入口的微流控芯片，具有更清晰的分离效果，双入口的微流控芯片在去除红细胞的效率上达到100%，而单入口的微流控芯片最多只能达到90%，而且双入口的微流控芯片不会对目标细胞的回收产生任何影响。采用正三角形的阵列结构与一般文献所采用的圆形结构相比，其临界分离尺寸更加精确，在设计的临界尺寸之上的细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于外周血循环肿瘤细胞的一次性分离芯片模块，其特征在于，包括微流控芯片、血液样本储液池、PBS样本储液池、废液储液池、富集回收液出口、微流控芯片与血液样本储液池的连接导管、微流控芯片与PBS样本储液池的连接导管、微流控芯片与废液储液池的连接导管以及微流控芯片与富集回收液出口的连接导管。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈艳，庞志强，崔彩媚，舒伟良，
申请(专利权)人：深圳睿思生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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