用于七种猪病病原鉴定的基因芯片及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于七种猪病病原鉴定的基因芯片及其检测方法，可以检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪传染性胃肠炎病毒。本发明专利技术通过标准毒株基因组序列分析设计PCR引物，对目的基因克隆及测序分析，设计特异性探针，构建了检测用基因芯片，并优化获得检测体系。本发明专利技术旨在建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片用于检测七种重要猪病病原的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物芯片领域。具体而言，本专利技术涉及一种猪传染性胸膜肺炎放线杆 菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和 猪传染性胃肠炎病毒等7种病原鉴别检测的芯片装置。
技术介绍
猪支原体肺炎（Mycoplasmapneumoniaeofswine,MPS)、猪传染性胸膜肺 炎（porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP)、猪多发性衆膜炎与关节炎（Swine polyserositisandarthrithis)、猪圆环病毒相关疾病（porcinecircovirus associateddisease,PCVAD)、猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveand respiratorysyndrome，PRRS)、猪痕（classicalswinefever,CSF)和猪传染性 胃肠炎（transmissiblegastroenteritisofswine，TGE)分别是由猪肺炎支原体 (Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,Hps)、猪圆环病毒（ porcinecircovirustype2,PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductive andrespiratorysyndromevirus,PRRSV)、猪 痕病毒（classicalswinefever virus,CSFV)和猪传染性胃肠炎病毒（porcinetransmissiblegastroenteritis virus，TGEV)引起的一类急性、接触性传染病，广泛存在于世界各地，严重影响我国养猪业 的发展。临床上，七种病原的单一感染均会给养猪业造成极大的危害，而近年来常出现几种 病原体混合感染或继发感染的现象，不仅加大了对猪群的危害，而且增加了病原快速准确 检测的难度。 近年来，随着全球一体化的加快，不断扩大的国际贸易为动物疫病的扩散增加了 机会。传统的病原分离鉴定和血清学方法，耗时长，需要专业的操作人员，已不能完全满 足进出口动物疫病的快速、准确及高通量检测。随着分子生物学的发展，聚合酶链式反应 (PCR)广泛应用于动物疫病的检测，但目前尚无可同时检测七种病原的检测方法。此外， APP、HPS和Mhp的培养条件比较苛刻，不利于分离培养；TGEV、PRRSV和CSFV均为RNA病毒， RNA易降解、不稳定性一定程度上增加病原检测的难度。基因芯片（Genechip)是由DNA或 寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探 针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA 通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品 种类，完成疾病检测和基础研究等方面的工作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动 化、低成本的优点。结合基因芯片的优势，建立一种快速检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、 副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪 传染性胃肠炎病毒的基因芯片技术，可满足进出口动物携带病原的快速、准确检测，有效防 止动物疫病通过国际贸易扩散传播。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微 阵列芯片用于检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒 2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪传染性胃肠炎病毒。 为了实现上述目的本专利技术采用的技术方案是：用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、 副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪 传染性胃肠炎病毒七种病原检测的基因芯片，包括：PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳 性对照、PCR阴性对照、ddH20、检测芯片、芯片探针的点样分布、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 检测探针的核苷酸序列、副猪嗜血杆菌检测探针的核苷酸序列、猪肺炎支原体检测探针的 核苷酸序列、猪圆环病毒2型检测探针的核苷酸序列、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测探针 的核苷酸序列、猪瘟病毒检测探针的核苷酸序列、猪传染性胃肠炎病毒检测探针的核苷酸 序列、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒。 采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修 饰的基片上，形成的微阵列。微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针 区内设置下述分区： 点样位置质控分区P1，包含至少一个点样位置质控探针，SEQIDN0. 8; 杂交阳性质控分区P2,包含至少一个杂交阳性质控探针，SEQIDNO. 9; 杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液； 所述待测样品探针区内设置下述至少一个待测样品探针的分区： 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针分区；副猪嗜血杆菌探针分区；猪支原体肺炎探针分 区；猪圆环病毒2型探针分区；猪繁殖与呼吸综合征病毒探针分区；猪瘟病毒探针分区； 猪传染性胃肠炎病毒探针分区。 各个探针序列如下： 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针：SEQIDNO. 1 ; 副猪嗜血杆菌探针：SEQIDNO. 2 ; 猪支原体肺炎探针：SEQIDNO. 3 ; 猪圆环病毒2型探针：SEQIDNO. 4 ; 猪繁殖与呼吸综合征病毒探针：SEQIDNO. 5 ; 猪瘟病毒探针：SEQIDNO. 6 ; 猪传染性胃肠炎病毒探针：SEQIDNO. 7。 利用上述芯片检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪 圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪传染性胃肠炎病毒的检测方法，包 括如下步骤： (1) 待测样品制备：按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取待测样品全基因 组DNA/RNA，制备待测样品DNA/cDNA; (2) ?0?扩增：25 1^?0?反应液包含：^39酶12.5 1^、引物組1:3.11^、待测 样品DNA/cDNA5yL、无核酸酶灭菌水4. 4uL; 其中，所述引物Mix含有： 序列为SEQIDN0. 10的10ymol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌上游引物0. 05yL， 序列为SEQIDNO. 11的10ymol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌下游引物0. 05yL， 序列为SEQIDNO. 12的10ymol/L副猪嗜血杆菌上游引物0. 1yL， 序列为SEQIDNO. 13的10ymol/L副猪嗜血杆菌下游引物0.lyL， 序列为SEQIDNO. 14的10ymol/L猪肺炎支原体上游引物0. 1yL， 序列为SEQIDNO. 15的10ym〇l/L猪肺炎支原体下游引物0.lyL， 序列为SEQIDNO. 16的10ymol/L猪圆环病毒2型上游引物0. 05yL， 序列为SEQIDNO. 17的10ymol/L猪圆环病毒2型下游引物0. 05yL， 序列为SEQIDNO. 18的10ymol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒上游引物0. 1yL， 序列为SEQIDNO. 本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于七种猪病病原鉴定的基因芯，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH2O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列，其特征在于：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：点样位置质控分区（P1），包含至少一个点样位置质控探针:SEQ ID NO.8；杂交阳性质控分区（P2），包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQ ID NO.9；杂交阴性质控分区（N），包含点样缓冲液；所述待测样品探针区内设置下述至少一个待测样品探针的分区：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针分区（1），副猪嗜血杆菌探针分区（2），猪肺炎支原体探针分区（3），猪圆环病毒2型探针分区（4），猪繁殖与呼吸综合征病毒探针分区（5），猪瘟病毒探针分区（6），猪传染性胃肠炎病毒探针分区（7）.各个探针序列如下：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针：SEQ ID NO.1；副猪嗜血杆菌探针：SEQ ID NO.2；猪肺炎支原体探针：SEQ ID NO.3；猪圆环病毒2型探针：SEQ ID NO.4；猪繁殖与呼吸综合征病毒探针：SEQ ID NO.5；猪瘟病毒探针：SEQ ID NO.6；猪传染性胃肠炎病毒探针：SEQ ID NO.7。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：聂福平，王昱，杨俊，李应国，王国民，保雨，艾军，李贤良，张强，
申请(专利权)人：重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：重庆;85