本发明专利技术公开了防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，包括：步骤一、将外源报告基因和花粉致死基因定点插入到野生型水稻染色体上育性调控基因的侧翼序列，得到含有外源报告基因和花粉致死基因的转基因株系，其中，外源报告基因、花粉致死基因与育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，步骤二、将野生型水稻与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交得到F1代植株，之后将F1代植株作为父本与转基因株系杂交得到F2代，从F2代中筛选含有外源报告基因的杂合株系即为所需水稻工程保持系，其中，纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为育性调控基因的突变体株系。本发明专利技术还公开了防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育种中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
水稻杂种优势利用是提高水稻产量最有效的途径。"三系法"杂交水稻对种质资源 利用率低以及"两系法"杂交水稻杂交制种安全性约束是影响杂交水稻种植推广面积进一 步扩大的重要因素。专利技术新的育种技术，开发出对种质资源利用率高、杂交制种安全的水稻 杂种优势利用方法是杂交水稻发展的方向。普通隐性核不育材料不育性稳定、杂交制种安 全，易于配制高产、优质、多抗组合；共同的缺点是无法实现不育系种子的批量繁殖。 针对隐性核雄性不育材料的繁殖问题，育种家也先后提出多种解决方案，主要包 括：⑴根据雄性不育机理，通过施加缺失的代谢中间物质（如氨基酸、黄酮、脂肪酸等物 质），使突变不育株恢复育性而得以繁殖；（2)在雄性不育株中，利用条件控制（如诱导性） 启动子驱动育性恢复基因表达，给予适合的启动子表达条件时，育性恢复基因表达，育性恢 复而得以繁殖；而不给予适合启动子表达的条件时，育性恢复基因不表达，即为不育系。此 外，也可以利用条件控制启动子驱动作物内源育性基因的抑制因子表达而达到上述同样的 目的。以上这些方案在不同作物的实际生产中得到了不同程度的应用，但由于不育系的育 性转换不能被完全精确地控制，或者不育系中含有转基因成分并因而造成杂交种中含有转 基因等问题，都没有得到广泛的应用。 随着分子设计育种思想和技术的进步，开发能够精确控制的不带转基因成分的不 育系的繁殖技术，成为分子设计杂交育种
亟需解决的问题。1993年6月11日，国 外生物技术公司PLANT GENETIC SYSTEM提出了一项PCT专利申请，该专利提出以下技术思 想：在隐性雄性不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因、花粉致死（败育）基因以及筛 选标记基因（如荧光蛋白基因）三套元件，可以获得该雄性不育植株的保持系，保持系通 过自交就可以实现不育系和保持系的繁殖。2002年，Perez-Prat等人提出，可以通过在纯 合的雄性不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因和筛选标记基因两套元件，由此获得该 雄性不育植株的保持系，保持系与不育株杂交即可繁殖不育系和保持系。两种方法提出了 利用精确的分子生物技术手段，解决隐性核雄性不育基因及不育材料的应用问题，为开展 分子设计杂交育种提供了技术框架。相比较而言，三元件系统考虑到花粉逃逸和转基因生 态风险的问题，较双元件系统思路更加缜密。2006年，美国杜邦先锋公司在三元件系统技 术思路基础上，首先在玉米中实现了基于核不育突变材料的种子生产技术，并命名为Seed Production Technology(SPT)技术。2010年9月，在中国科技部"国家高技术研究发展计 划"的支持下，三元件系统技术思想在水稻中得到了证实和应用，并被称之为"智能不育杂 交育种技术"或"第三代杂交水稻技术"。通过项目的实施，将有力推动智能不育分子设计 技术在作物育种中的研究应用，使我国在水稻杂交育种领域继续保持国际领先优势，为促 进生物育种产业的发展提供技术和产品支持。 从思路上来说，SPT技术几乎完美，既可以实现普通核不育系的繁殖，又可以消除 人们对于转基因风险的担忧，因为杂交后代植株中没有外源的转基因元件，不存在转基因 生物安全问题。但是在实际操作过程中会遇到以下几个问题：（1)转化受体取材受到限制， 因为互补载体要转化到不育植株中去，因此只有选择不育水稻植株的幼穗诱导愈伤组织； 取材受到很大限制，并且有效取材时间很短；（2)育性恢复基因的导入对突变不育株的表 型恢复并不十分理想，对于后续的制种产量影响很大。原因可能与载体序列在受体基因组 上的插入位点有关，侧翼序列的特征对育性恢复基因的表达水平可能会有影响。
技术实现思路
本专利技术的一个目的克服现有技术的不足，并提供至少后面将说明的优点。 针对存在的问题，我们对SPT技术进行了思路创新，利用最新的基因组编辑技术 CRISPR/Cas9系统将筛选报告基因（红色荧光蛋白基因，DsRed)表达元件和花粉致死基因 (ZmAAl)表达元件定点插入到育性调控基因的侧翼序列，实现育性恢复基因和筛选报告基 因、花粉致死基因的紧密连锁。 本专利技术另一个目的是提供一种防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，本发 明通过CRISPR/Cas9系统将外源报告基因和花粉致死基因整合到野生型水稻的染色体上， 解决了转化受体材料受限制的问题、避免了以前转基因的随机整合位点导致的目的基因表 达的不确定性、及花粉逃逸和转基因生态风险的问题。 本专利技术还有一个目的提供防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育种中的应用， 本专利技术的防止基因漂移的水稻工程保持系可用于水稻普通隐性雄性核不育系繁殖中，并且 能够避免花粉逃逸和转基因生态风险的问题，培育后的水稻工程保持系产品可机械化、规 模化应用于水稻普通核不育系的繁殖制种中，且过程简单、操作方便。 为此，本专利技术提供的技术方案为： 一种防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，包括： 步骤一、将外源报告基因和花粉致死基因ZmAAl定点插入到野生型水稻染色体上 育性调控基因的侧翼序列，得到含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAAl的转基因株系， 其中，外源报告基因、花粉致死基因ZmAAl与育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后 进入步骤二， 步骤二、将野生型水稻与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交得到F1代植株， 之后再取F1代植株作为父本与步骤一中得到的转基因株系杂交得到F2代，从该F2代中 筛选含有所述外源报告基因且育性基因位点杂合的株系即为所需要的水稻工程保持系，其 中，所述纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因的突变体株系。 优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，在所述步骤二之 后还包括： 步骤三、将步骤二中得到的水稻工程保持系自交，以生产水稻普通雄性核不育株 系种子和水稻工程保持系种子。 优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，在所述步骤一之 前还包括：通过图位克隆方法确定出纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中突变型育性调控 基因在染色体上的位置。 优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法中，所述步骤一中， 获得含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAAl的转基因株系的具体方法包括： 1. 1分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG 前面的20bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前 加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物 上游序列：5' -GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3' 下游序列：5'-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'； 1. 2利用CRISPR/Cas9系统将步骤1. 1中的引物序列构建到pPIC. 1载体上得到基 因整合载体； 1. 3将外源报告基因和花粉致死基因ZmAAl均构建到植物表达载体上得到重组表 达载体； 1. 4将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因植 株； 1. 5针对育性调控基因设计一对能够扩增出包含育性调控基因突变位点在内的 PCR产物的检测引物，利用该一对检测引物，以表达外源报告基因的转基因植株基因组作为 模板进行扩增，若检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，其特征在于，包括：步骤一、将外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1定点插入到野生型水稻染色体上育性调控基因的侧翼序列，得到含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系，其中，外源报告基因、花粉致死基因ZmAA1与育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，步骤二、取步骤一中得到的转基因株系作为母本，将野生型水稻与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交得到F1代植株，之后F1代植株作为父本与作为母本的转基因株系杂交得到F2代，从该F2代中筛选含有所述外源报告基因且育性基因位点杂合的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，所述纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因的突变体株系。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋书锋，李新奇，李莉，张大兵，符习勤，袁定阳，袁隆平，
申请(专利权)人：湖南杂交水稻研究中心，
类型：发明
国别省市：湖南;43
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。