提供了使用高分辨率/高准确度质谱法测定样品中IGF-I和/或IGF-II蛋白的量的方法。所述方法一般包括使样品中的IGF-I和/或IGF-II蛋白富集，电离来自所述样品的IGF-I和/或IGF-II蛋白以产生IGF-I和/或IGF-II蛋白离子，并用高分辨率/高准确度质谱法测定IGF-I和/或IGF-II蛋白离子的量。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】用高分辨率质谱法量化胰岛素样生长因子-I和胰岛素样 生长因子-M 本申请是分案申请，原申请的申请日为2010年11月4日、申请号为 2010800501946 (PCT/US2010/055518)、专利技术名称为"用高分辨率质谱法量化胰岛素样生长 因子-I和胰岛素样生长因子-II"。 相关专利申请的交叉引用 本申请要求于2009年11月5日提交的美国临时申请系列号61/258, 560和于2010 年10月29日提交的美国临时申请系列号61/408, 535的优先权，其通过参考以其包括所有 图和表的整体并入本文。 专利
本专利技术涉及使用质谱法定量分析大的蛋白质。
技术介绍
IGF-I是具有与胰岛素类似的分子结构的激素。它是由肝产生的肽并在具有三个 分子内二硫键的单链中包含70个氨基酸。IGF-I的分子量为约7, 649Da，并且在血清中是 高度蛋白结合的。通过生长激素刺激产生并可由于营养不足、生长激素不敏感性、缺乏生长 激素受体或下游信号传导途径故障而阻止产生。IGF-I在儿童生长中起重要的作用并在成 人中持续具有合成代谢作用。 胰岛素样生长因子II(IGF-II)也是具有与胰岛素类似的分子结构的激素。它是 包含67个氨基酸的单链肽。IGF-II分子量为约7, 50?a，并且在血清中是高度蛋白结合 的。IGF-II在与生长激素相关病症的临床评估中用作胰岛素样生长因子I(IGF-I)的辅助 物（adjunct)。IGF-II通过与IGF-I和不同细胞表面受体相互作用并使结合蛋白循环以调 节组织生长，主要在胎儿生长和发育中起作用。由于生长激素缺乏或营养不良，IGF-II在 儿童和成人中的水平降低。在肢端巨大症或IGF-I的外源给药可观察到增加的IGF-II血 清水平。因此，测量循环的IGF-II水平（即血浆/血清中）是控制数种生长激素相关病症 的重要工具。另外，在各种流行病学研究领域和临床试验中测量循环IGF-II也是有价值的 工具。 已经证实用"颠倒（bottmomup)"方法（S卩，酶消化和量化一种或多种所得肽） 量化分析IGF-I和IGF-II尤其是有挑战性的。例如，deKock等报道典型的胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶和胃蛋白酶消化方法产生低的消化产量和非特异性酶卵裂。deKock等，Rapid Commun.MassSpectrom. ,2001,15:1191-97。deKock等建议，不令人满意的消化结果可能 是因为由IGF-I的三个二硫键造成的蛋白水解酶的空间限制性。Id。 已经努力开发分析IGF-I和IGF-II的方法，包括通过各种质谱技术。例如，已经 报道了使用具有单离子监测（S頂）的LC-离子阱MS分析IGF-I。见，例如Id. ;Bobin等， Analyst，2001, 126:1996-2001 ;和Popot等，Chromatographia, 2001，54:737-741(Popot I)。这些参考文献公开了S頂模式中电荷状态范围为4+至9+的完整IGF-I的LC-ESI-离 子阱MS。最近，已经公开了使用多反应监测（MRM)的LC-MS/MS技术。PopotII报道使用 具有S頂的LC-离子阱MS定量分析电荷状态范围为4+至9+的IGF-I，随后用LC-离子阱 MS/MS使用MRM定性确认分析物。Popot等AnalBioanalChem, 2008, 390:1843-52(Popot II)。MRM实验使用所选择的多电荷IGF-I离子（7+和8+)作为裂解实验中的前体离子。 Bredehdft等报道使用轨道阱质谱仪器定性测定IGF-I前体和产物离子的质荷比，并使 用确定的离子使用LC-三重四极杆MS/MS用于随后的IGF-I定量。Bredehdft等Rapid Commun.MassSpectrom.，2008, 22:477-485〇 类似地，已经报道了使用酶消化随后质谱分析消化产物来分析 IGF-II。见，例如Smith等，J.Biol.Chem.，1989, 16:9314-9321 ;和Bayne等 P印tideResearch, 1990,6:271-273。已经报道了用于分析完整IGF-II质谱 检测的其他研究。见，例如，Hampton等J.Biol.Chem.，1989,32:19155-19160 ; Hayne等J.Chromatog. 1991，52:391-402;Wadensten等Biotech,andApp. Biochem. ,1991,13:412-421;Jespersen等J.MassSpectrom. ,1996,31:893-900;和 Nelson等J.Proteome, 2004, 3:851-855。这些参考文献报道用等离子体脱附和MALDI-TOF 质谱技术检测完整的IGF-II。Hampton等检测范围从1+至3+的电荷状态。除了Hampton 等之外都检测到1+电荷状态的IGF-II。
技术实现思路
本文描述的方法是用高分辨率/高准确度质谱法质谱测定样品中胰岛素样生长 因子I(IGF-I)蛋白和/或胰岛素样生长因子II(IGF-II)蛋白的量。该方法具有简化的预 分析步骤，其仅仅任选地包括蛋白质裂解、消化和/或检测蛋白质片段。优选地，样品收集 后不进行一种或多种完整蛋白的裂解或消化。 在本专利技术的第一方面，通过质谱法测定样品中IGF-I蛋白或其片段的量，所述质 谱法包括使来自样品的IGF-I蛋白或其片段在适合产生质谱法可检测的一种或多种IGF-I 离子的条件下电离；和通过高分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种IGF-I离子的量。 所测定的一种或多种IGF-I离子的量与样品中IGF-I蛋白或其片段的量相关。在一些实施 方式中，IGF-I蛋白或其片段源于样品。在一些实施方式中，IGF-I蛋白或其片段是完整的 长R3IGF-I或其片段。在一些实施方式中，IGF-I蛋白是完整的长R3IGF-I。 第二方面，通过质谱法测定样品中IGF-II蛋白或其片段的量，所述质谱法包括将 样品中的IGF-II蛋白或其片段在适合产生质谱法可检测的一种或多种IGF-II离子的条件 下电离；和通过高分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种IGF-II离子的量。所测定的一 种或多种IGF-II离子的量与样品中IGF-II蛋白或其片段的量相关。优选地，IGF-II蛋白 源于样品并且是完整的。 第三方面，IGF-I蛋白或其片段和IGF-II蛋白或其片段的量通过质谱法同时测 定，所述质谱法包括将来自样品的IGF-I蛋白或其片段和IGF-II蛋白或其片段在适合产生 质谱法可检测的一种或多种IGF-I离子和一种或多种IGF-II离子的条件下电离；和通过高 分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种IGF-I离子和一种或多种IGF-II离子的量。所 测定的IGF-I和IGF-II离子的量与样品中IGF-I和IGF-II蛋白或其片段的量相关。优选 地，IGF-I和IGF-II蛋白源于样品并且是完整的。 在一些实施方式中，样品可在电离之前通过固相提取（SPE)纯化。在一些实施方 式中，样品可在电离之前通过高效液相色谱法（HPLC)纯化。在相关实施方式中本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于测定样品中胰岛素样生长因子‑I(IGF‑I)蛋白和/或胰岛素样生长因子II(IGF‑II)蛋白的量的方法，所述方法包括：a.使所述样品中的所述蛋白在适合产生质谱法可检测的一种或多种离子的条件下电离；和b.通过高分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种所述离子的量；从而利用所测定的一种或多种离子的量测定所述样品中IGF‑I和/或IGF‑II蛋白的量。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·拜尔斯特姆，S·胜，N·J·克拉克，R·瑞茨，
申请(专利权)人：奎斯特诊断投资公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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