本发明专利技术公开了一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法，其方法为：第一步、设计特异性的定量引物；第二步、乳腺组织RNA的提取；第三步、将乳腺组织RNA反转录为cDNA；第四步、进行荧光定量PCR反应。有益效果：提供了一种简单、快速、低成本、精确度高、便于在基因组水平上筛查和检测C4BPA基因与奶牛乳脂代谢的相关性的定量PCR方法。为进一步研究该基因及探讨可能影响奶牛乳脂的基因提供了依据及可靠的研究方法。本发明专利技术筛查获得C4BPA基因与奶牛乳脂代谢相关，可用于奶牛的育种工作，以便满足不同人群对牛奶中乳脂含量的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种定量PCR检测方法，特别涉及一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定 量PCR检测方法。
技术介绍
当前，焚光定量PCR技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新 定量试验方法，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪， 实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，由于在PCR扩增的指数时 期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。荧光定量PCR 所使用的荧光化学有两种，一种是荧光探针，如TaqMan荧光探针，在PCR扩增时加入一对 引物同时也加入一个特异性的荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光 基团，当探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不发射荧光，但当PCR扩增 时，Taq酶的外切酶活性将探针酶切使其降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团相互分离， 从而荧光检测系统就可以接受到荧光信号，从而实现了对荧光信号的累积。另一种是SYBR 荧光染料，将SYBR荧光染料非特异性的插入DNA双链后，发射出荧光信号，而不能插入的 SYBR染料分子则不能发射荧光，这样保证荧光信号和PCR产物同步增加。 转录组测序是基因功能及结果研究的基础和出发点，通过高通量测序，能全面的 获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的所有转录本序列信息，而C4BPA基因是通过 对高乳脂奶牛及低乳脂奶牛的乳腺组织进行转录组测序选择出的差异基因。 C4(Complement 4)是补体系统中补体激活第一途径中的一个重要成分，1977年 Ferreira等报道了小鼠血清中的一种蛋白质，其分子结构模式现多以Dahlback等描述的 蜘蛛样结构来进行分析，能与补体C4成分特异性结合，同时也发现人中也有该种物质，而 这种物质被称为C4结合蛋白。 C4BP (complement component 4binding protein)是参与控制补体活化的抑制因 子，对维持补体在体内的平衡起重要的调节作用。C4BP也是作为I性因子的一种辅因子，促 进I性因子对C4b的裂解，也有抑制C3转化酶的活性的作用。C4BP是由7条相同的a链 和1条0链组成，并且C4b的结合位点是位于a链，而0链是蛋白质S的结合位点。2012 年Hillarp A等发现兔子和牛的血清中缺乏C4BP蛋白质S的复合体，0链基因未表达，而 鼠的0链基因也被进化成一种假基因。2014年Strickland DK等发现C4BP的a链上有 结合LRP的结合位点。LRP能够与多种结构及功能各异的配体相互作用，不仅可以对血脂 的动态平衡及纤溶系统功能的稳定进行调节的作用，而且能参与多种生长因子、细胞激酶、 生物学效应的发挥。C4BP可以通过结合孔蛋白，可以稳定调节血清对淋球菌的抵抗性，人 类的C4BP可以选择性的与淋病奈瑟氏菌相互作用，而造成物种间特异性的感染。2006年 Jenkins HT等发现C4BP与淋病奈瑟氏球菌、百日咳博德特氏杆菌、化脓性链球菌、大肠杆 菌的相互作用，是定位于C4BP的a链的不同区域，a链上有与其结合的相应位点，并使其 表达出相应的性状。因此进一步研究C4BP的a链具有重要的意义，研究其他功能和作用 也具有很大的价值。但目前对于C4BPA基因的研究还比较少，关于C4BPA基因与奶牛乳脂 代谢相关性的研究尚未有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法。 本专利技术提供的牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法，其方法如下所述： 第一步、设计特异性的定量引物，得到的引物序列如下所示： C4BPA 正向引物F: 5 ' AGATACACCTGTCGTCCTGGC 3 ' C4BPA 反向引物 R :5，TCTGTCTTAACTATCACTTGCCCA 3， 用所示的特异性定量引物在奶牛的基因组中进行PCR扩增，反应结束后，PCR扩增 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测； 第二步、乳腺组织RNA的提取： 取高乳脂和低乳脂奶牛的乳腺组织，利用Trizol法进行组织RNA提取，经过裂解、 分层、沉淀、洗涤、干燥及溶解的步骤，将获得的RNA进行分装，利用琼脂糖凝胶电泳检测 后，用分光光度计测总RNA的浓度，调整浓度统一后，于-80°C的冰箱冻存备用； 第三步、将乳腺组织RNA反转录为cDNA: 将提取的总RNA调整浓度统一后，采用反转录试剂盒将所提取的组织RNA反转 录成 cDNA 样品，总 RNA 的反转录体系：5XRNA RT Buffer 4. 0 y 1 ;dNTP Mixture 10mm 2.0 y1 ；01ig〇-dT 1.0 y1 ；AMV Reverse Transcriptase 0.5 y1 ；RNase inhibitor 0? 5 y 1 ;Total RNA 1. 0 y 1 ;RNase Free H207. 0 y 1，反转录条件为：7(TC 5min ;冰浴 2min ; 42°C 60min ;75°C 15min ;冰浴lOmin，所得产物储存于-80°C冰箱中备用； 第四步、进行荧光定量PCR反应： 进行荧光定量PCR时的反应体系20y 1，包括2XSYBR mix，10y 1 ;cDNA模板， 1.0卩1;(1(11120 8 卩1;上下游引物各0.5卩1，反应条件为：95。。308;95。。58,60。。308,40个 循环。 上述第二步中裂解、分层、沉淀、洗涤、干燥及溶解的具体步骤如下： 裂解：加入裂解液Trizol 1ml，将研磨好的组织粉末分别加入EP管中，室温下 裂解5Min ; 分层：加入0. 2ml的氯仿，颠倒混勾，15~30°C静置lOmin，再用4°C大离心机进 行离心，12000r离心15Min; 沉淀：吸上清置新的离心管中，加0.5ml的异丙醇充分混匀后15~30°C静置 10min，在4°C的低温离心机以12000r离心13Min，弃上清； 洗涤：加入1ml 75%的冷乙醇，轻轻洗涤沉淀，短暂震荡混匀，在4°C，12000r离心 5Min，弃上清； 干燥：室温空气干燥lOMinRNA沉淀至半透明； 溶解：加入适量的DEPC 0. 02ML处理水溶解，最后将获得的RNA进行分装。 本专利技术的有益效果：本专利技术通过对部分乳脂性状关联分析，尤其是对奶牛部分乳脂性状进行关联分析 并预测相应基因对其个体乳脂性状的影响。提供了一种简单、快速、低成本、精确度高、便于 在基因组水平上筛查和检测C4BPA基因与奶牛乳脂代谢的相关性的定量PCR方法。为进一 步研究该基因及探讨可能影响奶牛乳脂的基因提供了依据及可靠的研究方法。本专利技术筛查 获得C4BPA基因与奶牛乳脂代谢相关，可用于奶牛的育种工作，以便满足不同人群对牛奶 中乳脂含量的要求。【附图说明】 图1为奶牛乳腺组织中提取总RNA的电泳图。 图2为奶牛的目的基因PCR扩增产物电泳图。 图3为C4BPA基因在不同奶牛乳腺组织中的表达量差异分析的溶解曲线图。 图4为内参引物在不同奶牛乳腺组织中的表达量差异分析的溶解曲线图。【具体实施方式】 一、试验材料与方法： 1实验材料： 1. 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛乳脂代谢相关基因C4BPA定量PCR检测方法，其方法如下所述：第一步、设计特异性的定量引物，得到的引物序列如下所示：C4BPA正向引物F：5’AGATACACCTGTCGTCCTGGC 3’C4BPA反向引物R：5’TCTGTCTTAACTATCACTTGCCCA 3’用所示的特异性定量引物在奶牛的基因组中进行PCR扩增，反应结束后，PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；第二步、乳腺组织RNA的提取：取高乳脂和低乳脂奶牛的乳腺组织，利用Trizol法进行组织RNA提取，经过裂解、分层、沉淀、洗涤、干燥及溶解的步骤，将获得的RNA进行分装,利用琼脂糖凝胶电泳检测后，用分光光度计测总RNA的浓度，调整浓度统一后，于‑80℃的冰箱冻存备用；第三步、将乳腺组织RNA反转录为cDNA：将提取的总RNA调整浓度统一后，采用反转录试剂盒将所提取的组织RNA反转录成cDNA样品，总RNA的反转录体系：5×RNA RT Buffer 4.0μl；dNTP Mixture 10mm 2.0μl；Oligo‑dT 1.0μl；AMV Reverse Transcriptase0.5μl；RNase inhibitor 0.5μl；Total RNA 1.0μl；RNase Free H2O7.0μl，反转录条件为：70℃5min；冰浴2min；42℃60min；75℃15min；冰浴10min，所得产物储存于‑80℃冰箱中备用；第四步、进行荧光定量PCR反应：进行荧光定量PCR时的反应体系20μl，包括2×SYBR mix，10μl；cDNA模板，1.0μl；ddH2O 8μl；上下游引物各0.5μl，反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：芦春艳，赵志辉，杨润军，姜平，房希碧，龙小娟，肖航，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。