本发明专利技术提供了一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗及制备方法，其属于生物制药领域。以海藻酸钠为壁材，嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌灭活全菌为芯材，利用乳化法制备嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗。利用该嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌－海藻酸钙微囊口服疫苗免疫银鲫，能够显著提高的血清酶活性，白细胞吞噬活性，其对银鲫的相对保护率为：46.7％。微囊在模拟胃肠条件下稳定，表现出较好的突释性与缓释性；微囊中细菌抗原性保持良好，疫苗安全性与储存稳定性较好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物疫苗制备技术，具体涉及一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗及制备方法。本专利技术的疫苗主要适用于淡水鱼类。
技术介绍
嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌(Aeromonashydrophil)属于弧菌科、气单胞菌属，广泛存在于淡水、土壤、污水、淤泥和粪便中，有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病性菌株感染谱十分广泛，可引起鳖、虾、蟹、蛙、鸭等的爆发感染，人类感染此菌可引起食物中毒和软组织损伤感染，是淡水鱼类的主要病原菌。由该菌引起的细菌性败血症是我国养鱼史上危害鱼种类最多、危害鱼年龄范围最大、流行地区最广、危害养鱼水域类别最多、造成损失最严重的一种急性传染病之一。目前对本病的治疗药物，主要为抗生素和化学药物，大量长期使用易产生耐药株，而且化学药物会造成残留，污染水质，破坏生态平衡。所以，生产有效的疫苗是预防和控制本病的关键。嗜水气单胞菌疫苗及其相关技术在近几十年的研究与推广应用中，取得了一系列可喜的成绩。疫苗的种类也趋向于多样化，伴随着分子生物学和基因工程的出现和发展，出现了诸如核酸疫苗，基因工程疫苗，合成肽疫苗等新型鱼用疫苗。但这些疫苗也存在一些问题，如免疫效果不稳定、安全性较差、制备技术较困难、成本较高、缺乏合理有效方便的给予方法等，因此，这些疫苗在实际生产中的广泛应用还存在一定的困难。嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌是异源的，由于不同菌株间生理生化性状、血清型、基因型是有差异的，其致病性也由于它在表达毒力因子上的差异而不同，因而，在疫苗的普及上受到局限。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术提供一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗及制备方法。本专利技术的技术方案是：申请人制备了一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗，该灭活疫苗含有保藏号为CCTCCNO:M2013566的嗜水气单胞菌的抗原和保藏号为CCTCCNO:M2013565的维氏气单胞菌的抗原；所述抗原已灭活。所述嗜水气单胞菌的抗原和维氏气单胞菌的抗原体积比是1:1。申请人还提供了一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：将保藏号为CCTCCNO:M2013566的嗜水气单胞菌和保藏号为CCTCCNO:M2013565的维氏气单胞菌增殖培养后，收集菌体，加入磷酸缓冲液(PBS)至菌浓为1×108cfu/mL，然后加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，28℃摇床培养24h，嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的含量均为50％，制得二联菌的灭活疫苗。上述抗原菌株的分离鉴定方法如下所述：嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌菌株，申请人自新乡市患细菌性败血病的病鱼体内分离，其中嗜水气单胞菌32株，维氏气单胞力20株，冷冻干燥保存。根据攻毒试验中，每组鲫鱼的死亡情况，并结合个菌株毒力因子的特点，筛选出了毒力因子多，毒性强的菌株作为疫苗制备备用菌株:嗜水气单胞菌XDMG(1)AeromonashydrophilXDMG(1),其LD50为1.5×105cfu/mL。维氏气单胞菌XDLG(1)AeromonasveroniiXDLG(1),其LD50为4.5×105cfu/mL。以上菌株均于2013年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国湖北省武汉市武汉大学。其保藏号分别为CCTCCNO:M2013566和CCTCCNO:M2013565。取样时间为2010年7月,地点:新乡,卫辉东湖,分别取自于麦穗鱼和鲢鱼的肝部。本专利技术选取豫北地区毒力因子多、免疫源性高、毒性强的嗜水气单胞菌XDMG(1)AeromonashydrophilXDMG(1)及维氏气单胞菌XDLG(1)AeromonasveroniiXDLG(1)制成二联灭活疫苗。采用甲醛灭活制备疫苗，对鲫鱼(30～35g)进行腹腔注射，进行血清抗体效价检测，病理切片分析和攻毒保护试验。结果表明，鲫鱼在经注射免疫后，第3周即检测到凝集抗体，于第6周凝集效价达到高峰，而对照组在整个实验过程均没有检测到抗体；病理切片也表明，该疫苗能够对鲫鱼靶器官产生很好的保护作用；攻毒保护试验中，免疫组的免疫保护率达100％，且免疫保护期长达6个月以上。嗜水气单胞菌XDMG(1)AeromonashydrophilXDMG(1)及维氏气单胞菌XDLG(1)AeromonasveroniiXDLG(1)灭活疫苗对鲫鱼有显著的免疫保护效应，可作为预防细菌性败血症感染的疫苗。附图说明图1是3株A.AeromonashydrophilXDMG(1)中aer(1)、alt(2)、ahp(3)以及β-hly(4)基因的PCR扩增结果。图2三种来源苗菌株四种毒力基因相对表达1典型病鱼分离菌株2鱼源菌株3水源菌株。图3各组血清抗体效价平均值。图4光镜下实验组与对照组鱼的肝脏、脾脏、肾脏、肠道组织的组织切片。具体实施方式为了使本专利技术更易于理解，下面结合具体实施例对本专利技术做详细说明。单本实施例不是对本专利技术的限制。实施例1材料1.1菌株嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌菌株，自新乡市患细菌性败血病的病鱼体内分离，其中嗜水气单胞菌32株，维氏气单胞力20株，冷冻干燥保存。1.2试验动物健康鲫鱼购自新乡市郊某渔场，每条鱼质量约为30g，长度为12～15cm。使用前先于实验室驯养1周，充气，控制水温28℃左右，定期清污换水、喂食。1.3培养基LB营养肉汤的配制:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g,磷酸二氢钾1.0g，蒸馏水1000mL，混匀，加热溶解，调PH值至7.6，分装，112kPa高压灭菌15min。LB琼脂平板的配制:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，磷酸二氢钾1.0g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，混匀，加热溶解，调PH值至7.6，分装，112kPa高压灭菌15min，冷却至45℃无菌倾注平板。2方法2.1疫苗菌株的筛选2.1.1毒力因子PCR检测及分型4种引物：气溶素(aer)、β-溶血素(β-hly)、细胞兴奋肠毒素(alt)、丝氨酸胞外蛋白酶(ahp)均由上海生工生物技术公司合成，其序列见表1。采用25μL体系进行PCR反应，模板浓度为30ng/μL，琼脂糖凝胶进行电泳，检测4种毒力因子。表14种毒力基因PCR扩增引物序列及目的片段大小2.1.2毒力因子的实时定量分析设计的4种毒力基因的实时定量引物(见表2)。筛选出毒力因子多的菌株，提取RNA时行反转录合成cDNA，采用10μL体系在PR0961101428实时定量PCR仪器上进行反应，检测4种毒力因子的相对表达量。表24种毒力基因实时引物序列及目的片段大小2.1.3半数致死浓度(LD50)的测定实验室保存的菌株活化后，接种于营养肉汤28℃摇床培养16h。培养物利用血小球计数板计数，每株菌的实验组分5组，每组10尾鱼，将菌液以10-1，10-2，10-3，10-4倍比稀释，每稀释度菌液腹腔本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗，其特征在于，该灭活疫苗含有保藏号为CCTCC NO:M 2013566的嗜水气单胞菌的抗原和保藏号为CCTCC NO:M 2013565的维氏气单胞菌的抗原；所述抗原已灭活。
【技术特征摘要】
1.一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗，其特征在于，该灭活疫苗含有保藏号
为CCTCCNO:M2013566的嗜水气单胞菌的抗原和保藏号为CCTCCNO:M2013565的
维氏气单胞菌的抗原；所述抗原已灭活。
2.根据权利要求1所述的一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗，其特征在于，
所述嗜水气单胞菌的抗原和维氏气单胞菌的抗原体积比是1:1。
3.一种用于生产权利要求1所述的嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗的菌株，其
特征在于，该菌株分别是嗜水气单胞菌，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，
其保藏号为CCTCC...
【专利技术属性】
技术研发人员：关建义，刘涌涛，毛会丽，贺文旭，杨利敏，符运栋，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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