本发明专利技术公开了一种气单胞菌YQ及在酶法制备L-瓜氨酸中的应用，气单胞菌(Aeromonas sp.)YQ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M2015271，保藏日期：2015年5月3日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072；本发明专利技术筛选得到一株具有转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸能力的菌株Aeromonas sp.YQ，该菌全细胞可在30℃～37℃，180r/min，pH＝6的醋酸缓冲液中，作用3d，可将100g/L的底物L-精氨酸转化生成75g/L的L-瓜氨酸，产品纯度约为47.8％，整个工艺产品总收率为40％，为酶法生产L-瓜氨酸工业化奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一株产L-瓜氨酸菌种--气单胞菌(Aeromonassp.YQ)以及采用该菌株转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸的工艺方法。(二)
技术介绍
L-瓜氨酸(L-citrulline)是人体尿素循环中的一种重要代谢产物，能够吸收并清除有害的自由基从而起到抗氧化的作用。瓜氨酸可以使人的血管获得松弛，用于增强男性性功能，以及治疗性功能障碍。维护建康的肺功能，提高脑力清晰度，有帮助脑神经细胞具贮藏与调回讯息的功能。L-瓜氨酸可由L-精氨酸在精氨酸脱亚胺酶作用下，脱去亚氨基生成。目前，生产L-瓜氨酸的方法主要有：发酵法、化学合成法、提取法和酶转化法。发酵法生产的缺点是L-瓜氨酸产率低。化学合成法生产的产品中含有L-瓜氨酸的旋光对映体D-瓜氨酸。提取法的生产工艺相对困难，产品很难纯化，因此成本比较高。酶转化法优点是生产条件温和，产品中无D-型旋光对映体产生。酶转化法生产L-瓜氨酸是一种效率高，成本低的生产方法，将在瓜氨酸生产中起到重要作用。转化能力较强的菌株将在未来瓜氨酸生产中扮演重要角色。迄今尚没有气单胞菌(Aeromonassp.)酶转化法生产L-瓜氨酸的报道。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株可转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸的新菌株--气单胞菌(Aeromonassp.)YQ，及其酶法生产L-瓜氨酸的工艺方法。本专利技术采用的技术方案是：气单胞菌(Aeromonassp.)YQ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo：M2015271，保藏日期：2015年5月3日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。本专利技术菌株的获得：从浙江省杭州市勾庄西瓜大棚中采集的土壤样品，通过初筛，复筛，获得具有转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸能力的纯培养物。对该纯培养物进行了形态和生理生化鉴定，将其鉴定为气单胞菌(Aeromonassp.)，命名为气单胞菌YQ(Aeromonassp.YQ)。本专利技术还涉及所述的气单胞菌YQ在酶法制备L-瓜氨酸中的应用，具体所述的应用为：以气单胞菌YQ经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以L-精氨酸为底物，以pH＝6醋酸缓冲液为反应介质，在30℃～37℃，180r/min条件下进行转化反应，反应结束后，获得含L-瓜氨酸的混合液，将混合液分离纯化，获得L-瓜氨酸。进一步，所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为10.35g/L，所述底物的终浓度以缓冲液体积计为100g/L。进一步，所述混合液分离纯化的方法为：将混合液用截留分子量为6000的超滤膜过滤，透过液调整pH值至2后进行阳离子交换树脂柱层析(装填25mL湿732型树脂的内径13mm、高250mm的玻璃吸附柱进行动态吸附，上柱温度为室温)，以质量浓度1％的氨水作为洗脱液，以1.2BV/h的流速进行洗脱，洗脱液用量为6倍树脂体积，将收集的洗脱液用NKA-II树脂脱色，随后减压浓缩，再在浓缩液中加入无水乙醇进行结晶，晶体干燥，获得L-瓜氨酸。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术筛选得到一株具有转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸能力的菌株Aeromonassp.YQ，该菌全细胞可在30℃～37℃，180r/min，pH＝6的醋酸缓冲液中，作用3d，可将100g/L的底物L-精氨酸转化生成75g/L的L-瓜氨酸，产品纯度约为47.8％，整个工艺产品总收率为40％，为酶法生产L-瓜氨酸工业化奠定基础。(四)附图说明图1为菌株YQ在牛肉膏蛋白胨琼脂上的菌落形态图片；图2为菌株YQ的透射电镜图片；图3为菌株YQ的革兰氏染色镜检图片(球状的菌株为阳性对照，杆状为菌株YQ)；图4为菌株YQ的系统进化发育树；图5为L-瓜氨酸标准品高效液相色谱检测图谱(A)及L-瓜氨酸浓度计算的标准曲线(B)；图6为Aeromonassp.YQ不同天数的转化液高效液相色谱检测图谱(A)1d，(B)2d，(C)3d及转化液中L-瓜氨酸浓度的变化趋势(D)。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：酶转化法生产L-瓜氨酸菌株的筛选(1)菌株筛选采集浙江省杭州市勾庄西瓜大棚中采集的土壤样品，用生理盐水制成悬液，并用生理盐水梯度稀释，涂布于筛选培养基平板，置于培养箱中，37℃培养24h，产生红色变色圈较大的菌株即为初步筛选对象。将上述菌株接种于100ml发酵培养中，37℃，180r/min培养24h，离心收集菌体转入60ml含终浓度100g/LL-精氨酸的pH为6的醋酸缓冲溶液中，置于37℃摇床，180r/min转化1d。通过HPLC测定转化液中L-瓜氨酸的浓度，比较菌体转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸的能力。瓜氨酸出峰面积越大，表明菌株转化底物L-精氨酸能力越强，L-瓜氨酸产量越高。其中YQ菌株L-瓜氨酸峰面积最大为4403，转化液中瓜氨酸浓度达27g/L。保藏YQ菌株用于进一步试验。筛选培养基：蛋白胨1g/L，NaCl5g/L，KH2PO40.3g/L，L-精氨酸10g/L，酚红0.01，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH6.7。发酵培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，L-精氨酸2g/L，溶剂为去离子水，pH＝7.4。(2)菌株的鉴定菌株YQ在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上形成的菌落(如图1所示)为圆形，微白色半透明，表明光滑边缘整齐，中间凸起。通过透射电镜观察(如图2所示)，菌株YQ呈短杆状，两端钝圆，有一根极生鞭毛。菌体的大小为(0.2～0.4)μm×(1～2)μm，革兰氏染色阴性(图3所示)，不产芽孢。菌株生理生化特性测定结果为：甲基红实验，V-P实验，运动性实验，产硫化氢实验，明胶水解实验，接触酶实验阳性阳性。吲哚实验阴性。对该菌株YQ的DNA进行PCR扩增，以细菌16SrDNA通用引物，扩增到1439bp的DNA片段，GenBank中登录号为(KR612330)，通过NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示该菌株与气单胞菌属(Aeromonas)的序列同源性最高，采用MEGA5.05软件将该菌株的16SrDNA序列与Genbank中的若干个相关种的16SrDNA序列进行分析比对，以Plesiomonasshigelloides(NR_044827)为外群构建系统发育树，结果如图4所示，该菌株与Aerom本文档来自技高网...
【技术保护点】
气单胞菌(Aeromonas sp.)YQ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M 2015271，保藏日期：2015年5月3日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
【技术特征摘要】
1.气单胞菌(Aeromonassp.)YQ，保藏于中国典型培养物保藏中心，
保藏编号：CCTCCNo：M2015271，保藏日期：2015年5月3日，地址：中
国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述气单胞菌YQ在酶法生产L-瓜氨酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以气单胞菌
YQ经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以L-精氨酸为底物，以pH＝6醋酸
缓冲液为反应介质，在30℃～37℃，180r/min条件下进行转化反应，反应结
束后，获得含L-瓜氨酸的混合液，将混合液分离纯化，获得L-瓜氨酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体的用量以缓冲液体
积计为10.35g/L，所述底物的终浓度以缓冲液体积计为100g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体的制备方法为：将
气单胞菌YQ接种至斜面培养基，37℃培养24小时，获得斜面菌体；将斜
面菌体接种一环于装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，37℃，180
rpm下培养24小时，获得种子液；再以体积浓度4％的接种量将种子液...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴石金，戴安迪，邱乐泉，钟卫鸿，钟莉，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。