一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用。本发明专利技术提供的牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株是将布鲁氏菌BH1的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因，得到的菌株。通过实验证明：本发明专利技术的分子标记疫苗株BH1Δbp26ΔwboA-BL对布鲁氏菌病具有良好的免疫保护效果，毒力更小，安全性显著提高，可用于牛、羊等布鲁氏菌病的免疫预防，通过免疫学技术能将野生株感染动物与免疫动物区分开来，对布鲁氏菌病的监测、诊断、净化和控制具有重要意义，具有广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用。
技术介绍
布氏杆菌病(布病)是由布氏杆菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患传染病，该病传染性强，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。布病在我国流行范围广泛，危害严重，虽然自新中国成立后对布病开展了全面性的系统防御，但近些年来，该病的疫情呈明显上升趋势，被列为再度肆虐的传染病，引起国内各地区的高度关注。目前用于布鲁氏菌病防控的弱毒活疫苗主要有国外的牛型19号弱毒菌株(S19)和羊型Rev.1弱毒菌株，国内自主研制的羊型5号弱毒菌株(M5)和猪型2号弱毒菌株(S2)。在我国主要使用由S2株(猪型2号苗)制备的弱毒疫苗，该疫苗适用的宿主广泛，毒力弱，免疫保护持续时间较长，免疫保护效率较高，目前成功地防治了牛、羊、猪等布氏杆菌病；但该疫苗和其它光滑型布鲁氏菌疫苗一样存在一定缺陷，即免疫动物后，会在动物机体诱导产生S-LPS抗原“O”链特异性抗体，不能与野生菌株布鲁氏菌感染动物相区分，给布鲁氏菌病的诊断带来了很大的麻烦，这在一定程度上限制了疫苗的使用。因此，研制一种既具有良好的免疫保护效果，且安全性高，同时又能区分自然感染和疫苗免疫的标记型布鲁氏菌活疫苗具有重要的实际意义。bp26蛋白，又称为CP28(CytosolubleProtein)或OMP28，具有较强免疫原性，是一种可以由细胞内向外释放的可溶性外周浆蛋白，在不同种型布鲁氏菌间具有高度保守性，自然感染或人工免疫后都可以在血清中检测出针对此抗原的特异性抗体。研究发现，bp26基因的缺失突变对布鲁氏菌的生物学特性和免疫原性几乎没有影响，常被作为布鲁氏菌血清学检测的靶蛋白，被认为是目前布鲁氏菌最为合适的基因缺失疫苗分子标志之一。但有研究发现仅缺失布鲁氏菌bp26蛋白分子作为诊断抗原存在假阳性现象，而且，不同宿主动物对不同毒力菌株bp26基因编码蛋白的免疫原性存在差异，因此，以bp26蛋白作为鉴别诊断抗原会影响布鲁氏菌基因缺失疫苗的实际应用效果，从而，双基因缺失的布鲁氏菌减毒活疫苗受到越来越多的关注。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是布鲁氏菌外膜的主要成分，是一种重要的毒力因子，由类脂A、核心寡聚糖和O抗原三部分组成。LPS的完整性决定布鲁氏菌表型，对LPS合成过程中所需酶的编码基因进行突变可导致产生结构不完整的粗糙型LPS，使其毒力变弱，经常被用作减毒活菌苗候选株进行研究。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wboA、wz和wbkC。wboA基因编码一种糖基转移酶，该酶参与布鲁氏菌LPS中O链的形成，该基因的缺失或破坏会影响布氏杆菌光滑型表型的形成。RB51是由流产布鲁氏菌2308株通过利福平抗性筛选而获得，是一株缺少O-链的粗糙型菌株，免疫动物后血清中不产生抗O-链抗体，可用于布鲁氏菌病血清学的鉴别诊断。目前，RB51疫苗已被美国、墨西哥、智利等国家批准应用。布鲁氏菌的残余毒力是评价布鲁氏菌疫苗有效性的一个重要指标。一般疫苗要求残余毒力不能太强，否则会引起免疫动物病，但也不能太弱，否则不能刺激机体产生保护性免疫。研究表明，粗糙型布鲁氏菌虽然毒力下降，安全性提高，但可能由于过度弱化，致使免疫动物不能产生足够的保护力。另外，有些粗糙型菌株免疫动物后，仍能产生微弱地针对O-侧链的抗体，从而干扰布病的检测，使粗糙型菌株作为布病疫苗的实际应用价值遭受质疑。因此，研制既具有免疫保护作用，又能区分疫苗免疫和野生毒株感染的粗糙型布鲁氏菌标记疫苗已成为布鲁氏菌病疫苗的未来发展方向。在防治布鲁氏菌感染过程中，机体的细胞免疫是控制布鲁氏菌感染的关键。L7/L12蛋白是布鲁氏菌的一种核糖体蛋白，在菌体合成蛋白质多肽链的过程中通过与延伸因子(EFs)相互作用发挥功能，在各种生物型布鲁氏菌中较为保守，是布鲁氏菌侵染宿主过程中的优势抗原。有研究表明，L7/L12蛋白能特异性地刺激感染动物的单核细胞，刺激CD4+Th1淋巴辅助细胞释放IFN-γ因子，从而起到增强免疫保护效果的作用。粗糙型布鲁氏菌基因缺失疫苗虽然能够解决目前布鲁氏菌病活疫苗存在的难题，但可能会存在疫苗的免疫保护作用较弱的缺陷，这为疫苗的广泛使用带来了一定的限制。利用某些蛋白分子多亚基聚合体的聚合功能，扩展免疫原性分子的免疫原性，达到增强疫苗免疫保护效果的目的。目前报道的具有聚合和放大抗原免疫原性的多聚体蛋白主要是2,4-二氧四氢蝶啶合成酶(Lumazinesynthase，LS)。布鲁氏菌2,4-二氧四氢蝶啶合成酶(Brucellaspp.Lumazinesynthase，BLS)是先以二聚体的形式形成稳定的五聚物，再由两个稳定的五聚体形成一个十聚体，因此，BLS具有更高的热稳定性和更稳定的化学性质，有研究表明，在BLS的氨基末端插入外源性多肽片段不会改变BLS的三维结构，这为BLS作为提高抗原免疫原性的聚合功能提供了基础保证；此外，BLS具有较好的佐剂作用，JulianaCassataro等将Omp31的1oop区的27个氨基酸与BLS连接制备重组蛋白，免疫Balb/C小鼠后用绵羊附睾型布鲁氏菌攻毒，其保护性与ReV.1疫苗相当。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌是将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因，得到的菌株。上述重组菌中，所述将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因是将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且缺失所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段；所述布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段为序列表中序列4的第58-582位核苷酸分子；所述BLS蛋白的编码基因为序列表中序列2的第504-977位核苷酸分子；所述L7/L12蛋白的编码基因为序列表中序列2的第978-1352位核苷酸分子；所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段为序列表中序列5的第1-897位核苷酸分子。上述重组菌中，所述替换和所述缺失均通过同源重组的方式实现的；所述将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组菌，是将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因，得到的菌株。

【技术特征摘要】
1.一种重组菌，是将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因替换为BLS蛋白的编码基因和
L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因，得到的菌株。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基
因替换为BLS蛋白的编码基因和L7/L12蛋白的编码基因，且失活所述布鲁氏菌的wboA蛋
白的编码基因是将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段替换为BLS蛋白的编码基因
和L7/L12蛋白的编码基因，且缺失所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段；
所述布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段为序列表中序列4的第58-582位核苷
酸分子；
所述BLS蛋白的编码基因为序列表中序列2的第504-977位核苷酸分子；
所述L7/L12蛋白的编码基因为序列表中序列2的第978-1352位核苷酸分子；
所述布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段为序列表中序列5的第1-897位核苷
酸分子。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述替换和所述缺失均通过同源重
组的方式实现的；
所述将布鲁氏菌的bp26蛋白的编码基因的部分片段替换为BLS蛋白的编码基因和
L7/L12蛋白的编码基因是将含有bp26蛋白编码基因上游同源臂、BLS蛋白编码基因、L7/L12
蛋白编码基因和bp26蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段导入所述布鲁氏菌中实现同源重
组；
所述缺失布鲁氏菌的wboA蛋白的编码基因的部分片段是将含有wboA蛋白编码基因上
游同源臂和wboA蛋白编码基因下游同源臂的DNA片段导入所述布鲁氏菌中实现同源重组；
所述bp26蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列2中第1-503位；
所述bp26蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列2中第1353-2117位；
所述wboA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3中第1-618位；
所述wboA蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3中第619-1209位。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述含有bp...

【专利技术属性】
技术研发人员：王林叶，温丽娟，孙治华，王欢，李敏，杨定兴，
申请(专利权)人：内蒙古华希生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15