一种增强桑树耐盐能力的miRNA的克隆及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，提供了一种增强桑树耐盐能力的miRNA的克隆及其应用，该miRNA命名为mul-miRn1，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列，其前体RNA和编码基因序列分别具有序列表中SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列；在桑树中过表达SEQ.ID.NO.1所示的miRNA，可培育出具有较强耐盐性的转基因桑树；本发明专利技术的mul-miRn1为培育耐盐性桑树新品种提供了新的基因资源，同时在耐盐作物的培育中具有重要的意义和潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，提供了一种增强桑树耐盐能力的miRNA的克隆及其应用。
技术介绍
土壤干旱和盐渍化是世界范围内限制农林业生产的重要问题，已经引起国际社会的广泛关注。我国是世界上干旱和盐渍化最为严重的国家之一，干旱半干旱地区面积和盐渍化土地分别占全国可耕地面积的50％和20％以上。土壤干旱和盐渍化成为制约我国农林业发展及生态环境建设的重要因素。桑树是多年生经济树种，作为家蚕的饲料树种，是蚕丝产业的重要物质基础。同时，桑树对环境有极强的适应性，具有耐旱、耐盐碱、耐贫瘠、耐寒、耐涝等生理生态特性，广泛用于荒山绿化、防沙治沙、石漠化治理、水土保持、盐碱地治理、退耕还林等方面，具有良好的生态、经济和社会效益，目前已成为生态环境建设中的重要生态树种之一。因此，培育抗性新品种是增强桑树适应性，扩大栽培面积，实现其经济和生态价值的重要途径。miRNAs是一类长度约为20-25nt的非编码单链小分子RNA，可在转录水平对基因组区域进行特殊修饰而抑制靶基因转录，也可以在转录后水平介导具有同源序列的靶基因mRNA裂解或抑制其翻译，其功能涉及到生长发育、信号转导以及环境响应等生命进程的各个方面。研究表明miRNA在植物感受盐分胁迫并产生适应性的过程中也发挥着重要作用，植物可以通过诱导或抑制相应miRNA表达来调控相关基因表达水平，形成复杂的响应机制来适应盐分胁迫环境。目前国内外已从胡杨、陆地棉、大豆等作物克隆获得多个miRNAs基因并应用于分子育种且有多项研究成果申请了专利。其中包括张荃等专利技术的“一种与植物耐盐性相关的miRNA及其应用”(中国专利CN103114091A)，公开了一种来源于盐芥的与植物耐盐性相关的miRNA，在作物如小麦、水稻、玉米、棉花中过表达miRNA可培育出具有高耐盐性的转基因作物。刘进元等专利技术的“来源于棉花的miRNA—GramiRn22及其应用”(中国专利CN102250899A)，公开了一种miRNA—GramiRn22，应用该miRNA有望获得在耐受逆境胁迫以及生长发育方面有重要表型的植株。王兴军等专利技术的“一种盐芥耐盐性调控miRNA—tsa-miRn1927及其应用”(中国专利CN103146701A)，公开了一种盐芥耐盐性调控miRNA—tsa-miRn1927及其应用。所提供的盐芥耐盐性调控miRNA在植物耐逆性尤其是耐盐性中起重要作用。李霞等专利技术专利(中国专利CN102220334A、CN102220331A、CN102220332A、CN102220333A)，公开了几种与植物耐盐性相关的miRNAs，在大豆中过表达这些miRNAs可以培育出具有高耐盐性的转基因大豆。夏新莉等专利技术专利“胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法”(中国专利CN103361346A)，公开了一种与高盐逆境胁迫相关胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法。但关于miRNA在桑树抗盐育种中的作用，目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对上述现有技术的情况，提供了一种增强桑树耐盐能力的miRNA的克隆及其应用，该miRNA命名为mul-miRn1，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列，其前体RNA和编码基因序列分别具有序列表中SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列。利用SEQ.ID.NO.1所示的miRNA，可培育出具有高耐盐性的转基因桑树；本专利技术的mul-miRn1为培育耐盐性桑树新品种提供了新的基因资源，同时在耐盐作物的培育中具有重要的意义和潜在的应用价值。专利技术人首先提供了一种增强桑树耐盐能力的miRNA，该miRNA命名为mul-miRn1，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列；其前体RNA具有序列表中SEQ.ID.NO.2所示的核苷酸序列；其编码基因序列为SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列；除了如SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列之外，还包括能够在植物体内转录SEQ.ID.NO.2所示的miRNA前体RNA序列并且与SEQ.ID.NO.3所示序列具有90％以上相似度的核苷酸序列；此序列被导入植物细胞后可被转录成miRNA前体，所述的miRNA前体可在植物细胞中加工成成熟的miRNA，因此也在本专利技术的保护范围之列。本专利技术构建了桑树mul-miRn1基因的超表达载体pBI121mul-miRn1，将该表达载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，筛选转化子，采用叶盘转化法转化桑树。对获得的转基因桑树植株进行抗盐性分析表明，转基因桑树植株的耐盐能力显著提高，具有良好的应用前景。本专利技术涉及一种植物表达载体，包含有如SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列，用于提高桑树的耐盐能力。本专利技术提供了桑树mul-miRn1基因在植物中应用的方法，可提高植物的耐盐能力。步骤为：1)将mul-miRn1基因序列置于CaMV35S强启动子之下，构建植物表达载体pBI121mul-miRn1；2)将构建的表达载体转入农杆菌感受态细胞，筛选出转化子；3)利用2)获得的转化子转化桑树，得到转mul-miRn1基因桑树。基于上述的发现，专利技术人进一步通过基因工程技术在桑树中超量表达mul-miRn1基因，可培育出具有较高耐盐能力的转基因桑树；本专利技术的mul-miRn1为培育抗盐桑树新品种提供了新的基因资源，该基因可用于桑树或其他植物抗盐性育种研究。附图说明图1为mul-miRn1前体序列的二级结构图，本专利技术提供的miRNA来源于桑树，命名为mul-miRn1，其前体序列可折叠成一种稳定的茎环结构，属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征；图2为桑树mul-miRn1基因植物超表达载体pBI121mul-miRn1的构建图；图3为超表达载体pBI121mul-miRn1经BamHΙ和SacΙ双酶切的电泳图谱，图中M：MarkerDL2000；P：酶切产物，由图可知我们已经将桑树mul-miRn1基因核苷酸序列插入到植物表达载体pBI121中，成功构建了mul-miRn1基因植物超表达载体；图4为转基因植株的PCR鉴定结果示意图，图中WT：野生型桑树对照；L1-L3：转基因桑树阳性株系；M：MarkerDL2000；以筛选出的阳性植株的DNA为模板，根据35S启动子序列设计一对特异引物进行相应转基因株系的PCR扩增，结果均能扩增到530bp左右条带，说明我们已成功地将mul-miRn1基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强桑树耐盐能力的miRNA，其特征在于：该miRNA命名为mul‑miRn1，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种增强桑树耐盐能力的miRNA，其特征在于：该miRNA命名为
mul-miRn1，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列。
2.根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于：其前体RNA序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：冀宪领，盖英萍，张华梁，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37