安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，包括如下步骤：(1)选择对照动物模型；(2)样品采集；(3)耳组织DNA提取；(4)PCR扩增TLR4目的片段；(5)SSCP分析；(6)PCR扩增产物双向测序；(7)群体遗传学特性分析；(8)血清免疫指标的测定；(9)采用数学模型分析所检测到的TLR4基因遗传变异与血清免疫指标的关联性，并分析品种间血清免疫指标的差异性。旨在寻找与安徽地方猪种抗病性状相关的有效遗传标记，为安徽地方猪种质资源特性及抗病育种研究提供分子生物学参考。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法。
技术介绍
随着社会经济的发展，我国生猪养殖规模化程度越来越高，各种疾病的预防和控制变得更加重要和严峻。多种疾病给生猪养殖业的发展带来严重危害，造成经济损失，且从遗传育种的角度衡量，也严重影响了猪种一些重要经济性状的遗传改良。因此提高猪群的一般抗病力，可有助于降低生产成本，更有利于减少药物残留，提高猪肉产品质量、公共卫生安全及动物福利等。研究发现，一些猪病的发病机制是和猪本身的遗传背景相关的，因此应用遗传学方法，从遗传基础上提高猪对疾病的抗性具有治本的功效。以分子标记辅助选择(MAS)和候选基因分析为标志的分子育种技术，使猪抗病育种研究成为可能。分子抗病育种主要是借助MAS来提高选择的准确性，因此，寻找合适的分子标记和候选基因是关键。TLR4是TLRs家族重要成员，是细菌脂多糖或脂质A识别的主要受体，能识别多种革兰氏阴性病原菌、衣原体、螺旋体和病毒等病原微生物，触发激活特殊的信号途径，启动和调节机体的免疫反应，其受体基因的遗传差异可造成机体对多种病原体抵抗力不一。猪TLR4基因编码区全长2526bp，编码由841个氨基酸残基组成的多肽，由3个外显子组成，其中外显子3最长，含有2265bp，外显子1和2长度分别为216和167bp。自其被克隆、测序以来，研究者们就把猪TLR4作为疾病抗性的重要候选基因，研究其在呼吸系统、肠道系统疾病以及天然免疫反应中的作用。邱小田等将猪TLR4基因定位在SSC1q2.9-q2.13，并表明TLR4mRNA在心、肝、脾、肺、肾各种组织中均有表达且在肺中的表达量最高，认为TLR4在肺中的高表达与猪肺部疾病有关。包文斌等研究表明TLR4基因表达量的下调与F18大肠杆菌抗性具有一定关系。Yang等在PK-15细胞内确定了猪TLR4基因g.1605G＞T变异导致TLR4向下游传递信号的能力显著降低(P＜0.01)。鉴于TLR4基因在动物机体免疫应答中的重要性，对其多态性和遗传效应进行系统分析具有重要的理论和实践意义。断奶仔猪腹泻以及水肿病是当今规模化猪场养殖中一种常见的疾病。在仔猪的饲养管理过程中，断奶是一个极其重要的环节。仔猪断奶后，由于断奶应激，仔猪自身消化系统尚未发育完全，再加上来自母体的抗体来源终止等外界不良因素的影响，常常易导致仔猪断奶后发生腹泻(Post-weaningdiarrhea，PWD)和水肿病(Oedemadisease，OD)，其中F18大肠杆菌是最主要的致病源。至今为止，对于致病性大肠杆菌造成的危害，仍没有有效的预防措施和治疗方法，给养猪业带来巨大的经济损失。本专利技术所述研究以安徽三个本地品种(圩猪、皖南黑猪及安庆六白猪)和一个外来品种大白猪为试验对象，检测在该四个群体中TLR4基因的遗传变异。通过测定在易感染F18大肠杆菌的断奶培育时期仔猪的血清免疫指标，进行品种间的差异分析、以及基因型间的关联性分析，探讨断奶仔猪血清免疫指标在不同品种间的差异以及TLR4基因多态性对不同种群断奶仔猪血清免疫指标的遗传效应。旨在寻找与安徽地方猪种断奶仔猪抗病力相关的候选有效遗传标记，为安徽省地方猪种种质资源特性及抗病育种研究提供分子生物学参考。
技术实现思路
本专利技术提供了一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，本专利技术方法具有检测效果理想、成本低、操作简便的优点。一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，包括如下步骤：(1)对照动物模型的选择：选择安徽省地方猪种圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪与外来猪种大白猪28日龄断奶的仔猪为研究免疫指标品种差异的对照动物模型；(2)样品采集：仔猪35日龄时，采集耳样组织并空腹采血；(3)耳样组织DNA提取；(4)PCR扩增Toll样受体4即TLR4基因目的片段；(5)目的片段单链构象多态性即SSCP分析；(6)PCR扩增产物双向测序；(7)群体遗传学特性分析；(8)仔猪血清免疫指标的测定；(9)采用数学模型分析所检测到的TLR4基因的遗传变异与血清免疫指标的关联性，并分析品种间血清免疫指标的差异性；根据TLR4基因单核苷酸多态性即singlenucleotidepolymorphism：SNP与免疫指标的关联性分析，探讨所检测到的SNP位点对不同猪群断奶仔猪抗病性的指标是否有影响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗病育种的候选有效标记位点。本专利技术所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤(1)中所述对照动物模型的选择为：35日龄的圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪及大白猪28日龄断奶仔猪分别选择100、105、92、132头，其中圩猪采自广德安徽安泰农业开发有限公司，皖南黑猪采自绩溪安徽丰润生态农业开发有限公司，安庆六白猪采自望江安徽现代良种养殖有限公司，大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司。本专利技术所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤(2)中耳样组织采集过程为：提前在1.5mL的Eppendorf管中注入70％体积分数浓度的酒精，然后每头猪采耳组织块1.5g，装入所述Eppendorf管中，于-20℃保存备用。本专利技术所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤(3)中耳样组织DNA提取过程为：①用眼科剪剪取0.2g耳组织，去除其表面毛发及酒精，装入1.5mLEppendorf管中，并尽可能将耳组织剪碎；②DNA的提取采用北京全式金生物科技有限公司的组织DNA提取试剂盒提取；③将得到的DNA调终浓度至100ng/μL，放在2-8摄氏度保存；④DNA纯度检测：取1μLDNA在SMA1000上测定OD260/OD280的比值，当OD260/OD280比值在1.8-2.0之间说明所提DNA纯度较高；⑤质量检测：将所提DNA用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，观察提取产物的质量以便进行后续实验。本专利技术所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤(4)中PCR扩增目的片段的过程为：以步骤(3)获得的耳组织样DNA为模板，根据GenBank猪TLR4基因外显子3序列，其登录号为AY753179，采用PrimerPremier5.0软件设计2对引物，进行TLR4基因外显子3部分序列的克隆，并采用2％琼脂糖凝胶电泳检测克隆产物是否为目的片段；其中引物TLR4exon3-1的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1和SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对照动物模型的选择：选择安徽省地方猪种圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪与外来猪种大白猪28日龄断奶的仔猪为研究免疫指标品种差异的对照动物模型；(2)样品采集：仔猪35日龄时，采集耳样组织并空腹采血；(3)耳样组织DNA提取；(4)PCR扩增Toll样受体4即TLR4基因目的片段；(5)目的片段单链构象多态性即SSCP分析；(6)PCR扩增产物双向测序；(7)群体遗传学特性分析；(8)仔猪血清免疫指标的测定；(9)采用数学模型分析所检测到的TLR4基因的遗传变异与血清免疫指标的关联性，并分析品种间血清免疫指标的差异性；根据TLR4基因单核苷酸多态性SNP与免疫指标的关联性分析，探讨所检测到的SNP位点对不同猪群断奶仔猪抗病性指标是否有影响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗病育种的候选有效标记位点。

【技术特征摘要】
1.一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其特征在于，包括如
下步骤：
(1)对照动物模型的选择：选择安徽省地方猪种圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪与外来猪
种大白猪28日龄断奶的仔猪为研究免疫指标品种差异的对照动物模型；
(2)样品采集：仔猪35日龄时，采集耳样组织并空腹采血；
(3)耳样组织DNA提取；
(4)PCR扩增Toll样受体4即TLR4基因目的片段；
(5)目的片段单链构象多态性即SSCP分析；
(6)PCR扩增产物双向测序；
(7)群体遗传学特性分析；
(8)仔猪血清免疫指标的测定；
(9)采用数学模型分析所检测到的TLR4基因的遗传变异与血清免疫指标的关联性，并
分析品种间血清免疫指标的差异性；
根据TLR4基因单核苷酸多态性SNP与免疫指标的关联性分析，探讨所检测到的SNP位
点对不同猪群断奶仔猪抗病性指标是否有影响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪
抗病育种的候选有效标记位点。
2.根据权利要求1所述安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其特征
在于，所述步骤(1)中所述对照动物模型的选择为：35日龄的圩猪、皖南黑猪、安庆六白
猪及大白猪28日龄断奶仔猪分别选择100、105、92、132头，其中圩猪采自广德安徽安泰农
业开发有限公司，皖南黑猪采自绩溪安徽丰润生态农业开发有限公司，安庆六白猪采自望江
安徽现代良种养殖有限公司，大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司。
3.根据权利要求2所述安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其特征
在于，所述步骤(2)中耳样组织采集过程为：提前在1.5mL的Eppendorf管中注入70％体积
分数浓度的酒精，然后每头猪采耳组织块1.5g，装入所述Eppendorf管中，于-20℃保存备用。
4.根据权利要求3所述安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其特征
在于，所述步骤(3)中耳样组织DNA提取过程为：①用眼科剪剪取0.2g耳组织，去除其表
面毛发及酒精，装入1.5mLEppendorf管中，并尽可能将耳组织剪碎；②DNA的提取采用北
京全式金生物科技有限公司的组织DNA提取试剂盒提取；③将得到的DNA调终浓度至
100ng/μL，放在2-8摄氏度保存；④DNA纯度检测：取1μLDNA在SMA1000上测定

\tOD260/OD280的比值，当OD260/OD280比值在1.8-2.0之间说明所提DNA纯度较高；⑤质
量检测：将所提DNA用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，观察提取产物的质量以便进行后续实验。
5.根据权利要求4所述安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其特征
在于，所述步骤(4)中PCR扩增目的片段的过程为：以步骤(3)获得的耳组织样DNA为
模板，根据GenBank猪TLR4基因外显子3序列，其登录号为AY753179，采用PrimerPremier
5.0软件设计2对引物，进行TLR4基因外显子3部分序列的克隆，并采用2％琼脂糖凝胶电
泳检测克隆产物是否为目的片段；其中引物TLR4exon3-1的核苷酸序列如序列表中SEQID
NO：1和SEQIDNO：2所示，引物TLR4exon3-2的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3和SEQ
IDNO：4所示，退火温度及目的片段长度见表1。
表1猪TLR4基因引物序列
6.根据权利要求5所述安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其特征
在于，所述步骤(5)中目的片段单链构象多态性的过程为：先将所述TLR4-exon3-1、
TLR4-exon3-2引物对的PCR扩增产物分别进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后分别进行硝
酸银染色后用凝胶成像系统观察电泳结果得到所述断奶仔猪TAP1基因单链构象多态性；
其中，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具体包括如下步骤：
(A)清洗制胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁月云，张晓东，殷宗俊，张威，朱卫华，薛玮玮，黄龙，张梦琦，付坤，朱树娇，王源朗，张德磊，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34