一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其制备方法。是利用pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。本发明专利技术获得的AGV2病毒VP3可溶性表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3可容性蛋白作为AGV2诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展AGV2血清学流行病学调查及VP3功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其制备方法
本专利技术涉及一种可溶性蛋白，具体涉及一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其制备方法。
技术介绍
鸡的传染性贫血病毒(CAV)一直被认为是环形病毒属中唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个新型人源环形病毒HGyV序列。序列分析惊人发现，HGyV与AGV2的基因组序列同源性高达96％。最近，Maggi以及Biagini等人在健康人，器官移植病人以及HIV阳性病人血清样品中也检测到HGyV/AGV2的DNA序列。在国内，叶建强等检测并首次报道了活禽市场鸡群及人血样中AGV2的存在。这些表明AGV2具有潜在的公共卫生意义。然而目前所有的国内外对AGV2的检测均依赖于对AGV2的病毒基因组DNA的PCR扩增，目前尚无检测AGV2蛋白抗原及其抗体的血清学方法。对该病毒的组织嗜性、病毒蛋白表达及感染宿主中AGV2抗体水平等尚无报道。因此，对AGV2病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现可溶性表达，将为深入开展AGV2抗原及其抗体检测、血清学调查，明确AGV2在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究VP3生物学功能具有重要意义。在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种AGV2型环形病毒VP3蛋白及其制备方法。本专利技术的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。实现本专利技术的技术方案是：一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白，利用pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。进一步，所述pGEX-6p-1线性化载体是利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；上游引物：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；下游引物：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’。进一步，所述AGV2病毒VP3基因片段是利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因片段；上游引物：5’-GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3’；下游引物：5’-GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3’。本专利技术还提供了上述AGV2型环形病毒VP3蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；上游引物：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；下游引物：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’；。2)利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因；上游引物：5’-GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3’；下游引物：5’-GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3’。3)利用重组酶ExnaseTMII对步骤1)和2)得到的PCR产物在体外进行快速重组克隆VP3，阳性克隆经IPTG诱导表达，实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。本专利技术所述的AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白可作为AGV2诊断抗原；以及作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体。本专利技术与现有技术相比，其显著优点是：1、本专利技术中将利用不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTMII体外重组技术克隆AGV2病毒VP3基因，简化克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。2、本专利技术设计的引物及基于重组酶ExnaseTMII的克隆方法，可快速构建AGV2病毒VP3基因的原核可溶性表达载体。3、本专利技术获得的AGV2病毒VP3可溶性表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3可容性蛋白作为AGV2诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展AGV2血清学流行病学调查及VP3功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。附图说明图1是本专利技术AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法流程图。图2本专利技术PCR扩增产物的电泳分析图(泳道M表示对照品DNAMarker的电泳分析图，泳道1、2分别代表线性化载体pGEX-6p-1以及AGV2病毒VP3片段PCR扩增产物的电泳分析图)。图3是本专利技术AGV2病毒VP3基因的可溶性表达鉴定图(A是SDS-PAGE分析VP3蛋白的可溶性表达：泳道1、2、3分别代表IPTG诱导的VP3超声裂解样品上清，纯化后蛋白及超声裂解样品沉淀；泳道M为预染的蛋白分子量；B为抗GST单抗分析VP3蛋白表达：泳道1为IPTG诱导的VP3超声裂解样品；泳道2为IPTG诱导的GST超声裂解样品)。图4是本专利技术间接免疫荧光鉴定抗VP3蛋白多克隆抗体图(A为转染pcAGV2-VP1-3的293T细胞的间接免疫荧光结果；B为转染pcDNA3.1载体的293T细胞的间接免疫荧光结果)。具体实施方式为更好的理解本专利技术的内容，以下实施方式结合附图给出了AGV2新型环形病毒VP3可溶性蛋白制备的示例。实施例11)设计扩增pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段引物：扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1022-1047位；且在5‘端带有额外TAA碱基；扩增pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-941位；且在5‘端带有额外CAT碱基。扩增AGV2病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5‘端带有15个与pGEX-6p-1线性化载体下游引物反向互补的额外碱基；扩增AGV2病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5‘端带有15个与pGEX-6p-1线性化载体上游引物反向互补的额外碱基。具体引物序列见附表1。2)pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段PCR扩增：以pGEX-6p-1质粒以及pcAGV2-VP1-3质粒为模版，表1所述引物为引物进行PCR扩增。如图1中的步骤1。PCR扩增反应体系为：40μl水，5μl10倍缓冲液，1μl10mMdNTP，1μl10μmol上游引物，1μl10μmol下游本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白，其特征在于，利用pGEX‑6p‑1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白，其特征在于，利用pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白：所述pGEX-6p-1线性化载体是利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；上游引物：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；下游引物：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’；所述AGV2病毒VP3基因片段是利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因片段；上游引物：5’-GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3’；下游引物：5’-GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3’。2.一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；上游引物：5’-TAATGACGGTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，田晓彦，施洋洋，邵红霞，秦爱建，谢泉，夏驰超，周晓祥，范中雷，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32