本发明专利技术特别提供用于在制造期间表征重组乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)的方法。本发明专利技术使用毛细管区带电泳来确定重组HNS的电荷分布、同工型分布和/或聚糖分布；并且代表酶的批次一致性、储存稳定性、生物半衰期、药代动力学、药效学和生物活性的质量特征。特别是，这种表征方法可能有利于优化条件并且确保用于使用酶替代疗法治疗诊断为圣菲力浦综合征的患者的HNS的制造一致性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请 本申请要求于2013年3月13日提交的美国临时申请序列号61/779, 767的优先 权，所述临时申请的公开内容以引用的方式并入本文。 背景 乙酰肝素N-硫酸酯酶（HNS)是与硫酸乙酰肝素降解有关的溶酶体酶。导致缺乏这 种酶的遗传缺陷称为IIIA型粘多糖症或A型圣菲力浦疾病。这种罕见常染色体隐性疾病在 活产新生儿中的发生率为1/24, 000,并且没有被批准的医学治疗方法可用。目前在临床上 正在评估酶替代疗法（ERT)，其中将重组形式的外源酶引入受试者体内以弥补由遗传突变 导致的酶缺乏。具体地说，可以将重组HNS酶引入诊断为A型圣菲力浦疾病患者体内，以促 进硫酸乙酰肝素的降解和生物转换。为了进行治疗，通常使用基于细胞的表达系统来产生 重组HNS糖蛋白。通常，重组酶是包含5个潜在的N-糖基化位点以及若干用于翻译后修饰 的附加位点的54. 7kDa糖蛋白。这些修饰结构中的一些结构，诸如带有末端甘露糖-6-磷 酸者，对于生物功效来说是重要的，而另一些可能在蛋白质稳定性和/或溶解性中有作用。 由此，受到上游细胞培养和下游纯化过程两者影响的存在于最终重组产品中的不同糖形的 多样性可以对治疗性酶的潜在功效、药效学和药代动力学参数产生较大影响。 因此商业环境中的重组蛋白质治疗剂的生产需要控制制造过程，所述制造过程涉 及一系列灵敏分析方法以阐明产品的生理化学特性和监测其纯度、稳定性和/或活性。检 测出纯化的批次之间的细微的生理化学差异的能力对于实现受控的可靠生产过程以及一 致、安全且有效的产品是很重要的。专利技术概述 本专利技术特别提供改进的方法来阐明重组乙酰肝素N-硫酸酯酶（HNS)蛋白质的重 要生理化学特性，从而允许更有效地监测和控制由商业制造过程生产的产品的质量、纯度 和稳定性。因此，本专利技术允许更可靠的生产过程以及用于对A型圣菲力浦疾病进行有效的 酶替代疗法的一致、安全且有效的产品。可预料的是，本专利技术可适用于任何溶酶体酶。 部分地，本专利技术是基于以下发现：毛细管区带电泳可以用于精确表征编码与溶酶 体贮积病相关联的酶的重组蛋白质的生理化学特性。在一些具体实施方案中，重组蛋白质 编码HNS酶。可预料的是，溶酶体酶（S卩，HNS蛋白质）的一种生理化学特性，分子电荷，是 一种特别重要的属性。电荷微观异质性的程度可以归因于蛋白质结构的修饰（即，脱酰胺 作用）和/或连接至多肽链的碳水化合物部分。重要的是，分子电荷（即，带电碳水化合物 结构）的程度已经显示出在HNS蛋白质的生物功效和血清半衰期以及蛋白质抗原性、溶解 性和蛋白酶抗性方面具有重要影响。因此，重组溶酶体酶（如HNS)的天然电荷异质性的定 量分析和表征是产品开发的重要部分。 已知多种用于监测天然电荷异质性的不同分析技术，包括离子交换色谱法 (IEX-HPLC)、凝胶电泳等电聚焦（gel-IEF)、毛细管等电聚焦（cIEF)、成像cIEF和毛细管区 带电泳（CZE)。虽然这些技术各自都提供优点和劣势，但是用于解决指定蛋白质的电荷异质 性的最佳方法将根据具体情况而确定。如下文实施例部分所描述的，本专利技术表明毛细管区 带电泳特别适于表征溶酶体酶（如HNS)的天然电荷和聚糖分布，从而提供一定测定条件范 围内的高水平的再现性和稳定性。因此，本专利技术允许任何溶酶体酶的商业生产的标准化和 最优化。例如，这种方法可用于特别重组的HNS蛋白质。虽然HNS蛋白质用作实施例中描 述的CZE分析的实例，但是可以预料的是，本专利技术可以应用于任何溶酶体酶。 在一个方面中，本专利技术提供分析溶酶体酶（如乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白质）的方 法，其包括通过毛细管区带电泳来表征酶的电荷分布。在一些实施方案中，溶酶体酶是重组 产生的。在一些实施方案中，表征步骤包括通过毛细管区带电泳分离对应于电荷变化的峰 群的步骤。 在一些实施方案中，电荷分布包括少于14个对应于电荷变体的存在的峰群。在一 些实施方案中，电荷分布包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个对应于电荷变体的存 在的峰群。在一些实施方案中，电荷分布包括至少14个对应于电荷变体的存在的峰群。在 一些实施方案中，电荷分布包括至少14、15、16、17、18、19、20或21个对应于电荷变体的存 在的群。在一些实施方案中，峰群对应于与唾液酸的不存在、存在或量改变相关联的电荷变 体。在一些实施方案中，峰群对应于与甘露糖6-磷酸（M6P)的不存在、存在或量改变相关 联的电荷变体。在一些实施方案中，峰群对应于与唾液酸和/或甘露糖6-磷酸的不存在、 存在或量改变相关联的电荷变体。 在一些实施方案中，表征步骤包括定量地确定每个峰群的相对迀移时间。在一些 实施方案中，表征步骤包括定量地确定每个峰群的相对峰面积。在一些实施方案中，表征步 骤包括定量地确定每个峰群的相对迀移时间和/或相对峰面积。在一些实施方案中，相对 于电渗流（EOF)标志物来确定每个峰群的相对迀移时间。在一些实施方案中，使用超过一 个的EOF标志物。在一些实施方案中，通过与总峰面积比较的峰面积百分比来计算每个峰 群的相对峰面积。在一些实施方案中，所述方法还包括基于电荷分布来确定总唾液酸含量。在一些 实施方案中，所述方法还包括基于电荷分布来确定总甘露糖6-磷酸含量。在一些实施方案 中，所述方法还包括基于电荷分布来确定总唾液酸和/或甘露糖6-磷酸含量。在一些实施 方案中，确定唾液酸含量的方法包括确定单唾液酸化、双唾液酸化和/或三唾液酸化聚糖 的不存在、存在或量。在一些实施方案中，确定M6P含量的方法包括确定单M6P和/或双 M6P的不存在、存在或量。在一些实施方案中，所述方法还包括确定溶酶体酶（例如重组产生的HNS蛋白质） 的质量。在一些实施方案中，在制造生产开始时确定蛋白质的质量。在一些实施方案中，在 生产期间一次或多次确定溶酶体酶的质量。在一些实施方案中，在生产的不同阶段和/或 步骤期间确定溶酶体酶的质量。在一些实施方案中，确定溶酶体酶的质量以监测生产过程 中的进展、变化和/或偏差。在一些实施方案中，使用细胞培养系统来生产重组溶酶体酶蛋白质。在一些实施 方案中，溶酶体酶是HNS。在一些实施方案中，细胞培养系统使用哺乳动物细胞。在一些实 施方案中，使用的哺乳动物细胞是人类细胞。在一些实施方案中，在微小规模生产速率下生 产重组溶酶体酶。在一些实施方案中，在中等生产规模下生产溶酶体酶。在一些实施方案 中，在大规模生产速率下生产溶酶体酶。在一些实施方案中，所述方法包括确定在生产期间重组溶酶体酶（S卩，HNS)的电 荷分布是否存在变化。在一些实施方案中，通过在生产开始时确定酶的电荷分布来鉴定电 荷分布的变化。在一些实施方案中，通过在制造期间一次或多次确定酶的电荷来鉴定电荷 的变化。在一些实施方案中，通过在生产结束时确定酶的电荷分布来鉴定电荷的变化。在 一些实施方案中，通过比较在制造期间一次或多次收集的蛋白质电荷分布来确定酶电荷分 布的变化。在一些实施方案中，通过比较从使用相同制造方法生产的酶的一个或多个批次 收集的蛋白质电荷分布来确定溶酶体酶电荷分布的变化。在一些实施方案中，通过比较从 同一制造批次内生产的酶的一个或多个小批收集的蛋白质电荷分布来确定酶电荷分布的 变化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分析乙酰肝素N‑硫酸酯酶(HNS)蛋白质的方法，其包括通过毛细管区带电泳来表征HNS蛋白质的电荷分布。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·S·罗斯曼，
申请(专利权)人：夏尔人类遗传性治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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