对从染色的FFPET切片显微切割的材料的RT‑qPCR分析制造技术

本发明专利技术涉及用于经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学染色的方法，其包括以下步骤：a)提供固体支持物，b)将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片封固到固体支持物上，c)自经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去石蜡，d)于50至70℃加热固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复表位，并e)染色固体支持物上封固的组织切片，其中至少步骤e)在存在0.5至3.0M氯化钠的情况中实施。本发明专利技术进一步涉及用于实施所述方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对从染色的FFPET切片显微切割的材料的RT-qPCR分析专利技术背景本描述涉及用于经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学染色的方法，其包括以下步骤：a)提供固体支持物，b)将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片封固(mount)到固体支持物上，c)自经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去石蜡，d)于50至70℃加热固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复(retrieve)表位，并e)染色固体支持物上封固的组织切片，其中至少步骤e)在存在0.5至3.0M氯化钠的情况中实施。本描述进一步涉及用于实施所述方法的试剂盒。福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)是一种用于在临床常规中供诊断组织学和长期贮存用的组织固定的公知规程。使用FFPE组织(FFPET)样品的大型档案进行生物标志物发现研究及早期临床研究。此外，可以使用FFPET样品分离RNA，所述RNA可以在基因表达分析中进一步应用。虽然来自FFPET样品的RNA显示高度降解，但是它对于RT-qPCR分析仍然是足够的，只要使用足够量的材料进行RNA分离。可以使用此类分析来产生第一生物标志物假设并仅进行假设测试(Lohmann等,Methods.2013Jan；59(1))。为了能够自FFPE组织切片分离血管和肿瘤细胞巢并实施RT-qPCR分析，我们组合下述技术：免疫组织化学染色后自FFPET的激光捕捉显微切割(lasercapturemicro-dissection,LCM)与cDNA的预扩增后的RT-qPCR分析。技术人员在组合自经IHC染色的FFPET切片的LCM，接着进行RT-qPCR分析时面对的挑战是LCM后非常有限量的材料、样品组织固定后的RNA降解和另外免疫组织学染色规程期间的RNA降解。经典的染色规程包括表位修复(例如于98℃的HIER方案)和与不能在无RNA酶条件下生成的缓冲液(抗体溶液、清洗缓冲液、染料)的温育时间。若RNA意图在RT-qPCR分析中使用，则与LCM后非常有限量的材料组合的所描述RNA降解是此工作流的主要问题。RNA降解导致LCM后基因表达分析(例如感兴趣生物标志物和参照基因之间的比率)中不可靠的结果。mRNA稳定性是基因特异性的，并且因此它们在以不同程度降解，导致用于基因表达分析的相对定量的错误结果。为了克服此RNA降解问题，已经建立了不同规程以使降解保持为最小值。例如，大多数出版物使用新鲜冷冻(FreshFrozen,FF)组织，其在用于RT-qPCR分析时具有较少降解过程的优点。然而，主要的缺点是与FFPET相比FF组织是一种很大程度上有限来源的实情(Buckanovich等.,CancerBiolTher.2006Jun；5(6):635-42；Gjerdrum等.,DiagnMolPathol2004(13),p.224–233)。经常难以获得足够量的FF组织来实施产生统计学显著结果的研究。此外，可用于回顾测试的临床样品材料通常是FFPET。因此，此领域中的主要焦点是开发使RNA降解最小化的与LCM和RT-qPCR分析组合使用FFPET的技术。开发出用于FFPET切片的超快染色规程以使染色期间的RNA降解最小化。然而，分析来自此类显微切割的超快染色的FFPET切片的RNA显示了在以非常短的温育期(2次5分钟)抗体温育后，与简单组织染剂(苏木精)相比仍有约90％RNA被降解(Gjerdrum等.,DiagnMolPathol2004(13))。另外，超快染色方案不适用于所有抗体，因为一些需要几小时至过夜温育(Brown等,RNAJournal2009(15),p.2364-2374)。此类长期温育规程导致大量RNA降解，从而基因表达分析是简直不可能的。因此，本说明书的目的是提供用于随后为RNA分离使用的FFPET切片的改善的染色技术，其中改善的染色技术导致对于RNA分析(诸如基因表达分析)足够的自FFPET切片分离的RNA的产量(yield)和质量。专利技术概述发现了对固体支持物上封固的组织切片应用的本文中描述的染色方法中0.5至3.0M氯化钠的高盐浓度阻止随后自组织切片分离的RNA的降解。根据描述的方法适合于染色规程，其中在染色后分离RNA且其中需要高质量RNA，诸如用于基因表达分析。如此，本描述涉及对经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学染色的方法，其包括以下步骤：a)提供固体支持物，b)将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片封固到固体支持物上，c)自经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去石蜡，d)于50至70℃加热固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复表位，并e)染色固体支持物上封固的组织切片，其中至少步骤e)在存在0.5至3.0M氯化钠的情况中实施。此外，本描述涉及用于实施如本文中描述的方法的试剂盒，其中试剂盒包含a)用聚-赖氨酸包被的固体支持物，b)用于表位修复的溶液，和c)用于免疫组织化学染色的溶液，其包含0.5至3.0M浓度的氯化钠。附图简述图1：图显示了分离的RNA的光谱光度测定浓度分析(spectralphotometricconcentrationanalysis)的结果。描绘了来自从未染色的FFPET切片(未染色)分离的、从在没有氯化钠的情况中(没有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分离的和从在存在氯化钠的情况中(具有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分离的提取物的RNA浓度的中值+/-标准差。各从三个独立重复获得数据。图2：图显示了参照基因HPRT(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)的RT-qPCR分析的Cp值。描绘了来自RT-qPCR实验的Cp值的中值+/-标准差。RNA是从未染色的FFPET切片(未染色)分离的、从在没有氯化钠的情况中(没有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分离的和从在存在氯化钠的情况中(具有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分离的。各从三个独立重复获得数据。图3：图显示了参照基因ALAS1(delta-氨基乙酰丙酸合酶1)的RT-qPCR分析的Cp值。描绘了来自RT-qPCR实验的Cp值的中值+/-标准差。RNA是从未染色的FFPET切片(未染色)分离的、从在没有氯化钠的情况中(没有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分离的和从在存在氯化钠的情况中(具有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分离的。各从三个独立重复获得数据。图4：图显示了分别相对于参照基因HPRT标准化的标志物1和标志物2的表达。分别描绘了来自显微切割的肿瘤细胞和血管细胞的标志物1和标志物2的相对基因表达。一式两份实施实验。专利技术详述列出以下定义以例示并定义本文中使用的各项术语的意义和范围。除非上下文另有明确指示，术语“一个”、“一种”和“所述/该”一般包括复数提及物。如本文中使用的，与数值结合的术语“约”通过延伸高于和低于该值的边界来规定该值。一般地，术语“约”通过高或低5％的差异规定高于和低于叙述值的数值。例如，“约100”的值意指“95至105”的范围。术语“扩增”一般指从靶核酸生成多个核酸分子，其中引物与靶核酸分子上的特定位点杂交以提供通过聚合酶延伸的启动位点。可以通过本领域中公知的任何方法(诸如但不限于本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学染色的方法，其包括以下步骤：a)提供固体支持物，b)将所述经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片封固到所述固体支持物上，c)自所述经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去石蜡，d)于50至70℃加热所述固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复表位，并e)染色所述固体支持物上封固的所述组织切片，其中至少步骤e)在存在0.5至3.0M氯化钠的情况中实施。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.01.24 EP 13152579.21.用于经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学染色的方法，其包括以下步骤：a)提供固体支持物，b)将所述经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片封固到所述固体支持物上，c)自所述经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去石蜡，d)于50至70℃加热所述固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复表位，并e)染色所述固体支持物上封固的所述组织切片，其中至少步骤e)在存在0.5至3.0M氯化钠的情况中实施。2.权利要求1的方法，其中用聚-L-赖氨酸包被所述固体支持物。3.权利要求1的方法，其进一步包括以下步骤：f)自所述固体支持物上封固的染色组织切片切出感兴趣区域，g)自所述感兴趣区域分离RNA，h)将分离的RNA逆转录成cDNA，i)扩增和定量所述cDNA。4.权利要求3的方法，其中用聚-L-赖氨酸包被所述固体支持物。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中氯化钠以1.5至2.5M的浓度存在。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中氯化钠以约2M的浓度存在。7.权利要求1-6中任一项的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：B巴尔，A赫罗尔德，S洛曼，S穆斯曼，J舒斯特，M辛格，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH