本发明专利技术涉及枸橘甙在制备抗血管生成药物中的用途，属于医药工业领域。枸橘甙其化学结构式如下：本发明专利技术所述的枸橘甙可进一步加以合适的药学上可接受的载体制备抗肿瘤血管生成的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物工业领域，涉及枸橘甙的医药新用途，具体涉及枸橘甙在制备抗 血管生成药物中的用途。
技术介绍
血管生成是指在已经形成的血管结构基础上通过芽生或套叠式的方式生成新的 血管过程，是一种动态而又协调的复杂过程。这一过程主要包括血管内皮细胞、基质细胞 的增殖、迀移、分化，及后续的血管管腔化，整个血管生成的动态过程中受到多种血管生成 因子和血管生成抑制因子的联合调控。而在肿瘤的发生发展过程中，新生血管能够为肿瘤 生长提供必需的养料，构成肿瘤生长的物质基础，并为肿瘤浸润、转移和扩散提供必备的条 件。因此，目前临床上，通过抑制肿瘤血管生成，从而进一步抑制肿瘤生长、扩散与转移，目 前已成为转移性肿瘤治疗的一个重要的策略。 枸橘甙（Poncirin)(结构上式所示）是中国传统中药枸橘的重要成分之一，属于 黄酮类化合物。研究证实具有抗肿瘤、抗病毒、抗自由基等广泛的药理活性。。但尚未见在 异甘草苷抗肿瘤血管生成方面的研究。经化学结构分析我们发现异甘草苷具有新生血管小 分子抑制剂的结构特征：（1)有两个或两个以上的芳香基团；(2)芳香基团上有多个可以形 成氢键的受体或配体；（3)芳香基团间有linker键连接。因此我们推断该化合物可能通过 抑制肿瘤血管生成而达到抗肿瘤的作用。并且通过相关实验已初步证实。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供枸橘甙新的药物用途，具体涉及枸橘甙在制备抗血管生成 药物中的用途。 枸橘甙在制备抗血管生成药物中的用途，所述的枸橘甙其化学结构式如下： 所述的枸橘甙在制备抗血管生成药物中的用途，其特征在于：所述的血管生成是 肿瘤的血管生成。 所述的枸橘甙在制备抗血管生成药物中的用途，其特征在于：所述的用途是抑制 肿瘤生长过程中新生血管的形成。 本专利技术用四甲基偶氮唑盐（MTT)法、迀移抑制实验及鸡胚绒毛尿囊膜法（CAM法） 研究枸橘甙体外抗血管生成作用；用逆转录聚合酶链反应（RT-RCR)方法检测枸橘甙对肿 瘤细胞血管内皮生长因子A(VEGF-A)mRNA表达的影响。结果显示枸橘甙对血管内皮细胞增 殖表现出良好的抑制作用，IC5。值为27. 8±0. 2ymol?L\优于其抑制肿瘤细胞增殖的能 力（IC50彡33. 8±0.Iymol?L4 ;在体外该化合物能够明显抑制内皮细胞的迀移作用，同 时体内实验显示该化合物在30yg剂量浓度时能够显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形 成；RT-RCR实验显示枸橘甙在12. 5ymol?L1和25ymol?L1剂量时显著抑制A549细胞 的VEGF-AmRNA表达。 实验结果证实枸橘甙具有抑制新生血管形成作用，其作用机制与抑制血管内皮细 胞增殖以及降低肿瘤细胞表达VEGF的量有关。 本专利技术所述的枸橘甙可进一步加以合适的药学上可接受的载体制备抗肿瘤血管 生成的药物。【附图说明】图 1 枸橘甙（A-阴性对照组；B-IOymol.L1 组；C-20ymol.L1 组；D-30ymol.L1 组）对内皮细胞迀移的抑制作用； 图2枸橘甙对鸡胚CAM新生血管的抑制作用； 图3枸橘甙对A549细胞VEGF-AmRNA表达的影响。【具体实施方式】 实施案例1 :枸橘甙体外抗细胞增殖作用的研究 于对数生长期的人脐静脉内皮细胞（HUVEC)和肿瘤细胞（人淋巴细胞性白血病 CEM细胞、人前列腺癌PC-3细胞、人肺癌A549细胞株、人肝癌HepG2细胞株）接种于96孔板 中，接种密度约为每孔5000个细胞。接种24h后。将化合物（初始浓度为IOmmol*L4用 培养基分别稀释至100、50、10、Iymol吨1。吸去96孔板中的培养基，每孔加药IOOyL，各 浓度平行设三个孔，并设空白孔（不加MTT显色）和对照孔（不加药物），继续培养48h。然 后在每孔加入MTT溶液（5g吨3 20yL，37°C继续培育4h后，弃上培养基，每孔加入100yL DMS0,混匀振荡15s使甲臢充分溶解。最后用酶标仪在492nm处测定各孔OD值，记录结果。 以细胞存活率对剂量作图求IC5。值。 结果计算：细胞存活率=(试验组细胞OD值-空白组细胞OD值）八对照组细胞 OD值-空白组细胞OD值）X100%。细胞抑制率=(1-细胞存活率）X100%。半数抑制浓 度（IC50)即细胞抑制率为50%时药物的浓度。用药物的浓度为横坐标，细胞抑制率为纵坐 标作图，可求出IC5。值。 实验结果如表一所示。说明枸橘甙具有优先的抑制血管内皮细胞增殖的作用。同 时这一结果也说明枸橘甙对于肿瘤细胞增殖具有一定的抑制能力。 表一枸橘甙体外抗细胞增殖实验结果 所有实验均重复三次 实施案例2:枸橘甙抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC)迀移实验HUEVCs长满单层后，0.25 %的胰酶消化，调整细胞浓度为每毫升105个，在48孔细 胞培养板加入内皮细胞2X104个，置于37°C、含有5%C02的温箱中培养。细胞长满单层 后，用灭菌后的移液枪枪头刮去一条直线。弃去培养基，PBS洗3次，每次IOOyL。将化合物 (初始浓度为IOmmol吨1)用DMEM分别稀释至30、20、10ymol吨1。每孔加药200yL，各 浓度平行设三个孔。同时设置三个对照孔（即不加药物），置于37°C培养箱继续培养12h， 弃去培养基，PBS洗3次。10倍倒置显微镜下拍照，计算内皮细胞由刮除边缘细胞向刮除区 迀移到距离。 实验结果如图1所示，枸橘甙在10-30ymol? 1 1时对HUVEC的迀移有一定的抑 制作用，1〇、20、30ymol?L1的枸橘甙对HUVEC迀移数目的抑制率分别为22. 4%、35. 2%、 42. 76%，不同剂量的异甘草苷组间有显著差异。 实施案例3:枸橘甙抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的实验 在孵化9d的鸡胚气室端开一个IcmXIcm大小的正方形窗，暴露出尿囊膜，随后将 已制备好的含30mg枸橘甙的小纸片（5mm)放在绒毛尿囊膜血管较少的部位，用灭菌透明 胶带封窗后继续孵化。孵育3d后将鸡蛋放入4°C冰箱冻存24h。将冻存过的鸡蛋打在IOcm 直径的细胞培养平皿，剥离CAM(Chickchorioallantoicmembrane)膜，以加药滤纸片为中 心，剪取直径3cmCAM，平铺于干净培养皿中，用数码相机拍照。照相后，用固定液（甲醇： 丙酮，1:1)固定30min以上，烘干保存。 试验结果如图2所示，枸橘甙作用9日龄鸡胚尿囊膜72h后，表现出明显的抑制鸡 胚尿囊膜上血管生成能力。 实施案例4 :逆转录多聚酶链反应（RT-PCR)实验 取对数生长期的A549细胞接种于24孔板，培养24h，随后加入不同剂量枸橘甙继 续培养24h，抽提RNA收集并进行逆转录。VEGF-A正向引物：5 ' -GCAGAATCATCACGAAGTGG-3 '；VEGF-A逆向引物：5 ' -GCATGGTGATGITGGACTCC-3 '； B-actin正向引物：5」AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC-3' ； B-actin逆向引物：5' -GAAGTCCAGGGCGACGTAGCAC-3'。 PCR产物凝胶电泳后，紫外线灯下观测结果，计算条带的灰度值。 相对灰度值=(待测条带的灰度值/B-actin的灰度值）※待本文档来自技高网...
【技术保护点】
枸橘甙在制备抗血管生成药物中的用途，所述的枸橘甙其化学结构式如下：
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙明，律娜，尹宗生，李增，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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