本发明专利技术公开的是A群脑膜炎球菌的培养方法，解决了现有技术中直接从A群脑膜炎球菌中提取多糖的提取效率低，且提取出来的多糖不容易纯化的问题。本发明专利技术包括以下步骤：（1）制备纯化的工作种子批菌种；（2）开启工作种子批菌种，接种至半综合培养基中，在温度35～37℃条件下培养16～24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子；（3）将生产用种子接种至发酵罐培养6～12小时即可；发酵罐中培养基为半综合培养基，温度为35～37℃，培养基pH为7.0～7.2，发酵罐中搅拌速度为140～150r/min，接种量为10～15万/ml。本发明专利技术具有死菌较少、多糖纯化更容易、多糖提取率更高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种菌种的培养方法，具体涉及的是。
技术介绍
流行性脑脊髓膜炎(简称流脑，下同)是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道传染病。一百多年来，一直在世界各地流行或散在发生，感染病原菌后可引起败血症、脑膜炎。易感人群主要为儿童，以暴发型病死率最高，可达40%?60%。当今世界各大洲发病率在1/10万?10/10万，总病死率在5%?15%，高达20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症，包括智力受损和耳聋等。根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分13个血清型，其中A群、B群、C群约占流行菌群的90%。A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群，特别是在所谓的非洲“流脑流行带”，每隔7-14年就会出现一次较大流行。我国于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾发生过5次全国性流脑流行；其中以1967年春季流行最为严重，发病率高达403/10万，病死率为5.49%。我国过去90%以上的病例是A群病菌致病，现在B群或C群病菌有时亦引起流脑暴发。2003年开始，C群流脑的发病率明显上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有进一步增高的趋势。因此，目前我国预防流脑工作的重点是以预防A群和C群为主。目前预防流行性脑脊髓膜炎最有效的方法是接种疫苗。研究表明，A群C群脑膜炎球菌的荚膜多糖具有良好的免疫原性，提取荚膜多糖可直接制备成疫苗，经注射免疫后的人群可以获得免疫保护。我国从2007年起已将流脑疫苗纳入国家免疫规划，在全国范围对适龄儿童普及接种。目前纳入国家免疫计划的流脑多糖疫苗包括A群脑膜炎球菌多糖疫苗，A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗。现有技术中均是从A群脑膜炎球菌中提取出多糖制成多糖疫苗，进而达到预防脑膜炎的效果。因多糖是从荚膜中提取出来，如果菌种培养过程中死菌较多，容易导致直接从A群脑膜炎球菌中提取多糖的提取效率低，且提取出来的多糖不容易纯化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术中直接从A群脑膜炎球菌中提取多糖的提取效率低，且提取出来的多糖不容易纯化的问题，提供一种解决上述问题的。为解决上述缺点，本专利技术的技术方案如下: ，包括以下步骤: (O制备纯化的工作种子批菌种； (2)开启工作种子批菌种，接种至半综合培养基中，在温度35?37°C条件下培养16?24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子； (3)将生产用种子接种至发酵罐培养6?12小时即可；发酵罐中培养基为半综合培养基，温度为35?37°C，培养基pH为7.0?7.2，发酵罐中搅拌速度为140?150r/min，接种量为10?15万/ml ο优选地，所述步骤(I)的具体过程如下: 将A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种接种到纯化培养基上，在38°C条件下培育20h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种再接种到纯化培养基上进行二次培养，再在38°C条件下培育12h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种加入无菌脱脂牛奶中，混匀冻干制备即得纯化的工作种子批菌种。作为优选的实施方式，所述纯化种子的开启过程如下: 将工作种子批菌种溶解到无菌水中，将其接种在10%羊血琼脂培养基上，放于35?37°C的环境下培养16?20小时后，挑选出健壮且无杂菌污染的菌种即可。进一步，所述步骤(2)的具体培育过程如下: 将开启后的纯化种子接种到半综合液体培养基中进行活化培养；活化培养的条件为温度35?37°C、pH7.0?7.2、搅拌速度140?150r/min，培养时间为6?8h ;最后将活化后的纯化种子经过三代扩增培养，即可制备数量适宜的生产用种子。更进一步地，所述三代扩增培养的条件为:扩增培养用培养基为半综合液体培养基中；培育条件为温度35?37°C、pH7.0?7.2、搅拌速度140?150r/min。为了达到最好的效果，所述半综合液体培养基的组成配比如下: 牛肉浸出液1L，蛋白胨10g，氯化钠5g，无菌脱纤维马血、羊血或兔血10ml，葡萄糖3g，盐酸酪蛋白水解物2g，pH7.0?7.2。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点及有益效果: 本专利技术培育出的A群脑膜炎球菌的死菌较少，提取出的多糖纯化更加容易；而且多糖在荚膜中的提取率更高。【具体实施方式】下面结合实施例，对本专利技术作进一步地详细说明，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1 ，包括以下步骤: (I)制备纯化的工作种子批菌种:将A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种接种到纯化培养基上，在38°C条件下培育20h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种再接种到纯化培养基上进行二次培养，再在38°C条件下培育12h，挑选健壮且无杂菌污染的菌种加入无菌脱脂牛奶中，混匀冻干制备即得纯化的工作种子批菌种。(2)将工作种子批菌种溶解到无菌水中，将其接种在10%羊血琼脂培养基上，放于35?37°C的环境下培养16?20小时后，挑选出健壮且无杂菌污染的菌种； 将开启后的纯化种子接种到半综合液体培养基中进行活化培养；活化培养的条件为温度35?37°C、pH7.0?7.2、搅拌速度140?150r/min，培养时间为6?8h ; 最后将活化后的纯化种子经过三代扩增培养，即可制备数量适宜的生产用种子；其中扩增培养用培养基为半综合液体培养基中；培育条件为温度35?37°C、pH7.0?7.2、搅拌速度 140 ?150r/min。(3)将生产用种子接种至发酵罐培养6?12小时即可；发酵罐中培养基为半综合培养基，温度为35?37°C，培养基pH为7.0?7.2，发酵罐中搅拌速度为140?150r/min，接种量为10?15万/ml。本实施例中，各步骤中的具体培育条件如下: 步骤(2)工作种子批菌种开启的培育条件为35°C，培养18小时；活化培养的条件为温度37°C、pH7.2、搅拌速度140r/min，培养时间为6?8h ;扩增培养的培育条件为温度36°C、ρΗ7.0、搅拌速度 145r/min ； 步骤(3)中发酵罐培养的培育条件为温度为37°C，培养基pH为7.0，搅拌速度为145r/min，接种量为12万/ml。且步骤(I)中采用的纯化培养基为加入抗生素的巧克力培养基，有效达到纯化的目的；步骤(2)中开启工作种子批菌种所使用培养基为未加入抗生素的巧克力培养基，SP10%羊血琼脂培养基，通过该培养基的培养后即可有效达到开启工作种子批菌种的效果。活化和扩增用培养所用的培养基均是半综合液体培养基，该培养基的配比为:牛肉浸出液1L，蛋白胨10g，氯化钠5g，无菌脱纤维马血、羊血或兔血100ml，葡萄糖3g，盐酸酪蛋白水解物28，？!17.0?7.2。实施例2 本实施例与实施例1的区别仅仅在于，各步骤中的具体培育条件不同，具体设置如下:步骤(2)工作种子批菌种开启的培育条件为36°C，培养16小时；活化培养的条件为温度37°C、pH7.0、搅拌速度145r/min，培养时间为8h ;扩增培养的培育条件为温度37°C、pH7.0、搅拌速度 150r/min ； 步骤(3)中发酵罐培养的培育条件为温度为37°C，培养基pH为7.0，搅拌速度为150r/min，接种量为15万/ml。实施例3 本实施例与实施例1的区别仅仅在于，各步骤中的具体培育条件不同，具体设置如下本文档来自技高网...
【技术保护点】
A群脑膜炎球菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备纯化的工作种子批菌种；（2）开启工作种子批菌种，接种至半综合培养基中，在温度35～37℃条件下培养16～24小时，然后经过三代扩增培养，制备数量适宜的生产用种子；（3）将生产用种子接种至发酵罐培养6～12小时即可；发酵罐中培养基为半综合培养基，温度为35～37℃，培养基pH为7.0～7.2，发酵罐中搅拌速度为140～150r/min，接种量为10～15万/ml。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱冲，米强，陈道远，
申请(专利权)人：成都欧林生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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