本发明专利技术涉及一种酵母菌富集铜离子的驯化培养和检测方法；驯化培养方法为首先配制不同铜离子浓度驯化培养基和基础培养基；将所培养的产朊假丝酵母种子液，接种到不同铜离子浓度驯化培养基中，摇床培养；选择所培养的菌液中OD600值高，上清液中铜离子的含量较低的产朊假丝酵母菌作为出发菌种；取出发菌种菌液，接种到最低含铜离子的浓度为的驯化培养基中，摇瓶培养后，再吸取菌液接种到浓度为次低的驯化培养基中，按照此方法，接种培养；最后检测不同代次产朊假丝酵母的铜离子转化率，当铜离子的转化率不变或降低时，该菌种即为富铜酵母生产菌种。本发明专利技术所培养的酵母菌可在高铜离子浓度培养基中生长，对铜离子的转化效率高，为酵母新功能开发提供基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酵母菌培养方法，具体的说是一种酵母菌富集铜离子的驯化培养 和检测方法。
技术介绍
随着我国经济的飞速发展和人民生活水平的不断提高，对肉、蛋、奶、皮、毛、羽等 畜产品的需求与日倶增。这导致了我国畜牧业的飞速发展，养殖种类增加，养殖规模加 大，饲料在养殖业中所占的成本比例和产值也在不断扩大。2013年，全国商品饲料总产量 1. 934亿吨（产值6784亿元），已经成为国民经济的支柱产业。微量金属元素是动物体必 不可少的营养物质，参与多种代谢途径。然而，最初的微量元素都是以无机盐的形式添加， 在动物体内的转化效率低，大部分随粪便排到环境当中，严重污染环境。大剂量的无机盐添 加还会影响到饲料的适口性，使动物的采食量降低。 酵母是一种单细胞真菌，细胞个体大，且酵母富含维生素、酶、寡糖等营养物质，被 列为单细胞蛋白饲料的范围内。在对酵母研究的一系列成果中均证明，酵母在自身代谢过 程中能够利用多种微量元素转化为自身成分，或者与酵母体内氨基酸结合变成金属元素氨 基酸螯合物，这种形式存在的金属元素在动物体内能够与氨基酸一起直接被消化道上皮细 胞吸收，大大提高了生物学效价，降低了金属离子的使用量。同时酵母培养简单，培养成本 低，本方案采用无机铜离子(硫酸铜）作为铜源，培养和驯化酵母，然后作为动物饲料使用， 既可以降低养殖业无机铜的使用，减少环境污染；又能够提供酵母蛋白，改善饲料品质。 现有的专利技术专利如：专利201210595217采用酵母菌液态发酵法将无机铜硫酸铜 转化为有机酵母铜，所涉及的菌株为酿酒酵母CGMCC-6438,该专利技术所生产的产品铜含量可 达21. 47mg/g风干菌体重，产量可达16. 05g/L风干菌体。专利200910066547提供一种酵母 铜、酵母铁和酵母锌复合仔猪饲料添加剂，由酵母铜、酵母铁和酵母锌组成。该专利技术相对于 现有饲料具有的优点在于：通过添加酵母铜、酵母铁、酵母锌，既减少铜、铁和锌的添加量， 又可避免微量元素铜、铁和锌之间的颉颃作用，提高仔猪的生长性能、增强仔猪的抗氧化作 用和免疫功能以及预防疾病的优点。这两个专利技术前者主要是利用酿酒酵母生产酿酒酵 母铜产品，最终以产品形式体现，所用菌种也局限在了酿酒酵母，没有形成富铜酵母培养和 驯化的系统方法。后者主要是一种简单的有机微量元素复配，重点是作为有机微量元素添 加剂产品，也没有体现酵母对铜离子的耐受力和如何培养驯化的方法。
技术实现思路
本专利技术目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种酵母菌富集铜离子的驯化培 养和检测方法，所培养的酵母菌在250ug/mL的铜离子浓度培养基中正常生长，对铜离子的 转化效率达到95. 6%，为酵母新功能开发提供基础。 -种酵母菌富集铜离子的驯化培养方法，包括以下步骤： (1)、驯化培养基的配制：每lOOOmL蒸馏水中加入玉米浆40g，糖蜜20g，葡萄糖5g， 硝酸铵2g，硫酸镁0. 2g和磷酸二氢钾0. 5g，搅拌至完全溶解后用盐酸或氨水调节pH值 为5. 0,将所得混合溶液分为10份，分别添加硫酸铜调整混合溶液中铜离子的浓度分别 为：0?156ymol/mL、0. 313ymol/mL、0. 469ymol/mL、0. 625ymol/mL、0. 781ymol/mL、 1. 563ymol/mL、2. 344ymol/mL、3. 125ymol/mL、3. 906ymol/ml,和 4. 688ymol/ml,,得至lj 十种不同铜离子浓度的驯化培养基，分别装入10个三角瓶中，装液量为三角瓶体积的20%， 进行高压蒸汽灭菌后，备用； 基础液体培养基的配制：每l〇〇〇mL蒸馏水中加入蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g和蒸馏水l〇〇〇mL，搅拌至完全溶解后用盐酸或氨水调节pH值为5. 0,备用； (2) 、产朊假丝酵母培养：挑取2-3接种环活化后的产朊假丝酵母斜面菌种，接种到装 有基础培养基的试管中，30°C下，220rpm/min摇床培养至菌液的0D600值为1. 0,得到产朊 假丝酵母种子液，备用； (3) 、将产朊假丝酵母种子液分别接种到上述步骤（1)所制备10个装有不同铜离子 浓度驯化培养基的三角瓶中；将接种后的10个三角瓶置于30°C下，220rpm/min，摇床培 养14h，得到产朊假丝酵母菌液；分别检测上述步骤（3)中所培养的产朊假丝酵母菌液其 0D600值和上清液中铜离子的含量； (4) 、选择上述步骤（3)中所培养的产朊假丝酵母菌其菌液0D600值最高，且其菌液中 铜离子的含量最低的产朊假丝酵母菌，作为出发菌种；取上述步骤（3)所培养的该出发菌 种的菌液lmL，接种到铜离子的浓度为0. 781umol/mL的50mL驯化培养基中，30°C下，摇瓶培 养14h后，吸取lmL菌液接种到铜离子的浓度为1. 563umol/mL的50mL驯化培养基中，30°C 下，摇瓶培养14h，吸取lmL菌液接种到铜离子的浓度为2. 344umol/mL的驯化培养基中， 30°C下，摇瓶培养14h，再次吸取lmL菌液，接种到铜离子的浓度为3. 125umol/mL的驯化 培养基中，30°C下，摇瓶培养14h，再次吸取lmL菌液，接种到铜离子的浓度为3. 906umol/ mL的驯化培养基中，30°C下，摇瓶培养14h，再次吸取lmL菌液，接种到铜离子的浓度为 4. 688umol/mL的驯化培养基中，30°C下，摇瓶培养14h;在培养过程中，所培养的菌液除接 种外所剩余菌液均存放于冰箱中，备用； (5) 、将上述步骤（4)冰箱中所保存的菌液取出，分别检测不同代次产朊假丝酵母的铜 离子转化率，当铜离子的转化率不变或降低时，认为达到该菌种对铜离子的最大耐受能力； 保留此菌种作为富铜酵母生产菌种，以此时的培养基配方作为生产富铜酵母的最佳培养基 配方。步骤（5)中所述检测不同代次产朊假丝酵母的铜离子转化率的方法为： (1)、称取恒重的硫酸铜配制成铜离子浓度为0. 156umol/mL的铜离子标准液，用移液 枪依次吸取0. 50mL、1. 00mL、1. 50mL、2. 00mL和2. 50mL铜离子标准液，分别移入5个体积为 125mL的分液漏斗中；另外取1个不添加铜离子标准液的分液漏斗，即空白对照；然后分别 在6个分液漏斗中添加硫酸至分液漏斗中的溶液体积为20mL;然后，分别向6个分液漏斗 中依次加入5mL柠檬酸铵和乙二胺四乙酸二钠的混合水溶液、3滴酚红试剂，摇匀后，采用 氨水将分液漏斗中的溶液调至红色；接着，再分别加入2mL二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶 液和10mL四氯化碳溶液，剧烈振摇2min，静置等分层后，分别用脱脂棉将四氯化碳层滤入 体积为2cm的比色杯中；采用四氯化碳调节零点，在波长为440nm处测铜标准溶液的吸光 度，用铜标准溶液各点吸光值减去空白对照管吸光值后，在软件中绘制标准曲线并计算回 归方程； (2)、取lml冰箱中所保存的待检测菌液加入到离心管中，放入3000r/min的离心机 中离心2min，取上清液置于分别250mL具塞锥形瓶中，加入lOOmL盐酸，充分摇匀后，转入 250mL容量瓶中，加水定容至250mL;吸取5mL容量瓶中溶液置于体积为125本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酵母菌富集铜离子的驯化培养方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）、驯化培养基的配制：每1000mL蒸馏水中加入玉米浆40g，糖蜜20g，葡萄糖5g，硝酸铵2g，硫酸镁0.2g和磷酸二氢钾0.5g，搅拌至完全溶解后用盐酸或氨水调节pH值为5.0，将所得混合溶液分为10份，分别添加硫酸铜调整混合溶液中铜离子的浓度分别为 ：0.156 μmol/mL、0.313μmol/mL、0.469μmol/mL、0.625μmol/mL、0.781μmol/mL、1.563μmol/mL、2.344μmol/mL、3.125μmol/mL、3.906μmol/mL和4.688μmol/mL，得到十种不同铜离子浓度的筛选培养基，分别装入10个三角瓶中，装液量为三角瓶体积的20%，进行高压蒸汽灭菌后，备用；基础液体培养基的配制：每1000mL蒸馏水中加入蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g和蒸馏水1000mL，搅拌至完全溶解后用盐酸或氨水调节pH值为5.0，备用；（2）、产朊假丝酵母培养：挑取2‑3接种环活化后的产朊假丝酵母斜面菌种，接种到装有基础培养基的试管中，30℃下，220rpm/min摇床培养至菌液的OD600值为1.0，得到产朊假丝酵母种子液，备用；（3）、将产朊假丝酵母种子液分别接种到上述步骤（1）所制备10个装有不同铜离子浓度的驯化培养基的三角瓶中；将接种后的10个三角瓶置于30℃下，220rpm/min，摇床培养14h，得到产朊假丝酵母菌液；分别检测上述步骤（3）中所培养的产朊假丝酵母菌液其OD600值和上清液中铜离子的含量；（4）、选择上述步骤（3）中所培养的产朊假丝酵母菌其菌液OD600值最高，且其菌液中铜离子的含量最低的产朊假丝酵母菌，作为出发菌种；取上述步骤（3）所培养的该出发菌种的菌液1mL，接种到铜离子的浓度为0.781umol/mL的50mL驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h后，吸取1mL菌液接种到铜离子的浓度为1.563umol/mL的50mL驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 吸取1mL菌液接种到铜离子的浓度为2.344umol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 再次吸取1mL菌液，接种到铜离子的浓度为3.125umol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 再次吸取1mL菌液，接种到铜离子的浓度为3.906umol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h, 再次吸取1mL菌液，接种到铜离子的浓度为4.688umol/mL的驯化培养基中，30℃下，摇瓶培养14h；在培养过程中，所培养的菌液除接种外所剩余菌液均存放于冰箱中，备用；（5）、将上述步骤（4）冰箱中所保存的菌液取出，分别检测不同代次产朊假丝酵母的铜离子转化率，当铜离子的转化率不变或降低时，认为达到该菌种对铜离子的最大耐受能力；保留此菌种作为富铜酵母生产菌种，以此时的培养基配方作为生产富铜酵母的最佳培养基配方。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李旺，宋洋洋，李元晓，武晓红，丁轲，张光勤，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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