一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法技术

一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法，涉及木聚糖。1)取配制好的糖标准品溶液或生物质水解液加到NaOH溶液中，加入PMP甲醇溶液，反应后取出冷却，用HCl中和，用氯仿萃取，漩涡震荡后除去有机溶剂，离心，取上清液稀释检测；2)采用C18反相色谱柱进行HPLC检测，当衍生物通过检测器时获得峰面积响应值，即可实现定性分析；3)若需定量分析，将糖标准品溶液逐级稀释，依次进样，根据步骤2)测定的峰面积响应值对相应标准糖的进样浓度进行线性回归，建立回归方程，表征峰面积响应值与糖的进样浓度之间的关系，根据峰面积响应值判断未知样品中的糖浓度，再计算当信噪比为2～5时对应的标准溶液浓度以确定最低检测限。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及木聚糖，尤其是涉及用于多糖水解液中单糖和寡糖的快速分析的一种 利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法。
技术介绍
木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素是由D-葡萄糖 基以β_1，4糖苷键连接而成的均一聚糖，其主要水解产物为纤维二糖和葡萄糖。半纤维素 结构较为复杂，一般主要成分为以D-木糖为主链、多种糖基为侧链的木聚糖，组成木聚糖 的主要糖基有：D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、4-0-甲 基葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。木质纤维素生物质中木聚糖可以通过酸催化或者酶水解选择 性转化为木糖或者低聚木糖。低聚木糖由于其独特的生理功能，已于2008年被中国卫生部 批准为新资源食品（卫生部，2008)。利用富含木聚糖的木质纤维素生物质生产木糖或者低 聚木糖具有巨大市场前景。目前，对于复杂的木质纤维素生物质水解产物，特别是低聚木糖 尚缺乏快速、灵敏和高效的分析方法。常用的糖类化合物分析检测方法有：高效液相色谱 法（HPLC)、气相色谱法（GC)和离子色谱法（HPAEC)。糖类物质缺少紫外吸收，利用高效液 相色谱法检测糖类物质通常要配备示差检测器（RID)。HPLC-RID对糖的检测灵敏度较低 并且对低聚木糖分离效果不佳。由于糖类化合物较难挥发，利用GC检测糖类只能采用间 接的方法，一般是通过将糖进行糖醇衍生化变成易挥发性化合物，再进行检测。利用GC检 测时，糖的衍生化步骤繁琐，并且大多数情况下只用于单糖的检测，少有检测寡糖的报道。 HPAEC-PAD已经广泛应用于各种单糖和寡糖的分析，但由于其洗脱液中含有高浓度的盐，限 制了其与质谱的联用。仅用HPLC-RID或者HPAEC-PAD分析，无法对复杂的木聚糖水解液中 缺乏商业化标准品的糖类进行定性分析。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)能显著提高 糖的离子化程度和检测的灵敏度。PMP柱前衍生化HPLC分析方法由于其具有较高的灵敏度 和分离效率，已经被广泛应用于单糖的分析，在已有的报道中，一般采用中性或偏酸性的流 动相来进行分析，其流动相一般pH < 8. 0。该方法在流动相pH多8. 1用于同时分析木质纤 维素生物质中的单糖和寡糖尚无报道。研究结果表明，流动相PH显著影响PMP衍生化糖类 化合物的分离，调整流动相的pH多8. 1，各类单糖和寡糖的PMP衍生物的分离度可以有效提 尚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)为衍生化试剂，采 用碱性流动相（pH彡8. 1)、紫外检测器和C-18色谱柱，建立PMP柱前衍生化的一种利用高 效液相色谱分析木聚糖水解液的方法。 本专利技术包括以下步骤： 1)取配制好的糖标准品溶液或生物质水解液加到NaOH溶液中，再加入PMP甲醇 溶液，反应后取出冷却至室温，用HCl中和，然后用氯仿萃取，漩涡震荡后除去有机溶剂，离 心，取上清液稀释检测； 2)采用C18反相色谱柱进行HPLC检测，当衍生物通过检测器时获得峰面积响应 值，即可实现定性分析； 3)若需定量分析，将糖标准品溶液逐级稀释1~30倍，依次进样，根据步骤2)测 定的峰面积响应值对相应标准糖的进样浓度进行线性回归，建立回归方程y = ax+b，表征 峰面积响应值y与糖的进样浓度X之间的关系，从而根据峰面积响应值可以判断未知样品 中的糖浓度。再计算当信噪比为2~5时所对应的标准溶液的浓度以确定最低检测限。 在步骤1)中，所述配制好的糖标准品溶液或生物质水解液、NaOH溶液、PMP甲醇 溶液、HC1、氯仿的体积比可为（1~1000) yL : (1~1000) yL : (1~1000) yL : (1~ 1000) μ L : 0. 1~5. OmL，所述NaOH溶液的摩尔浓度可为0. 1~10mol/L，所述PMP甲醇溶 液的摩尔浓度可为〇· 1~l〇mol/L，所述HCl的摩尔浓度可为0· 1~10mol/L ;所述反应的 温度可为30~100°C，反应的时间可为5~150min ;所述离心可在2000~20000rpm下离 心0· 5~15min ;所述稀释可稀释1~100倍。 在步骤2)中，所述C18反相色谱柱内涂有18烷基碳链的反相固定相，含碳量 5 %~11 %，直径L 0~4. 0臟，粒度1~8 μ m ;所述HPLC检测的流速可为0· 1~2. OmL/ min ;流动相A可为磷酸缓冲液，pH多8. 1，磷酸缓冲液的摩尔浓度可为0. 01~1.0 Omol/ L ;流动相B为乙腈，采用等度洗脱，流动相A :流动相B = (4~0. 5) : 1 ;紫外检测波长， 230 ~270nm〇 本专利技术的检测对象包括但不限于木聚糖水解液、商品功能性保健糖等。 本专利技术利用PMP对木聚糖水解液中的单糖和寡糖进行衍生化，通过优化高效液相 色谱分离条件，首次在碱性流动相（pH多8. 1)条件下实现了多种单糖（甘露糖、鼠李糖、葡 萄糖、木糖和阿拉伯糖）和寡糖（纤维二糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖）的 分析。本专利技术具有如下的有益效果： (1)采用的设备相对便宜（相对于离子色谱）。 (2)采用的设备配件相对便宜（相对于糖分析柱和示差检测器），降低了分析成 本。 (3)操作简单、反应条件温和，既可定性分析，也可定量分析，可以与质谱联用，具 有良好的市场应用前景，为木质纤维素生物质转化为燃料和化学品过程的研究奠定基础。 此外，基于PMP衍生化的HPLC方法能高效分析多种生物质水解液实际样品中的单 糖和寡糖。该方法在利用木质纤维素生物质生产燃料和高附加值化学品中具有广阔的应用 前景。 本专利技术建立了 PMP柱前衍生化的HPLC分析木质纤维素生物质中单糖和寡糖方法， 为木质纤维素生物质转化为燃料和化学品过程的研究奠定基础。【附图说明】 图1为定性分析含有甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的木聚 糖硫酸水解液。在图1中，图a为标准品，图b为木聚糖硫酸水解液。 图2为定性分析低聚木糖标准品和芒草的木聚糖酶水解产物。在图2中，图a为 低聚木糖标准品，图b为芒草的木聚糖酶水解产物。【具体实施方式】 以下通过实施例将结合附图对本专利技术作进一步的说明。 实施例1 : 本实施例定性分析含有甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的木 聚糖硫酸水解液混合物（已中和至中性），具体过程如下所示： 步骤1.取上述糖的标准品和混合有上述糖的木聚糖硫酸水解液100 μ L，分别加 至Ij 100 μ L 0. 3mol/L NaOH溶液中，再加入100 μ L的PMP甲醇溶液（0. 5mol/L)，混合均匀 后，在70°C下反应30min后取出冷却至室温，用IOOyL 0.3mol/L HCl进行中和。然后用 ImL氯仿进行萃取，漩涡震荡后除去有机溶剂，重复三次，离心（12000rpm，5min)，取上清液 稀释到一定倍数进行检测。 步骤 2. HPLC 检测条件：色谱柱（CAPCELL PAK C1SMG，3. Omm i. d. X 250mm，5 μ m); 流速0. 4mL/min ;流动相A为磷酸缓冲液（0. 04mol/L，pH 8. 5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法，其特征在于包括以下步骤：1)取配制好的糖标准品溶液或生物质水解液加到NaOH溶液中，再加入PMP甲醇溶液，反应后取出冷却至室温，用HCl中和，然后用氯仿萃取，漩涡震荡后除去有机溶剂，离心，取上清液稀释检测；2)采用C18反相色谱柱进行HPLC检测，当衍生物通过检测器时获得峰面积响应值，即实现定性分析；3)若需定量分析，将糖标准品溶液逐级稀释1～30倍，依次进样，根据步骤2)测定的峰面积响应值对相应标准糖的进样浓度进行线性回归，建立回归方程y＝ax+b，表征峰面积响应值y与糖的进样浓度x之间的关系，从而根据峰面积响应值可以判断未知样品中的糖浓度，再计算当信噪比为2～5时所对应的标准溶液的浓度以确定最低检测限。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘健，龙敏南，甘礼惠，黎海龙，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35