本发明专利技术公开了一种抗毒蕈碱3型受体第一环抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤1：多肽合成；步骤2.用M3受体胞外区免疫C57/B6小鼠；步骤3.ELISA方法检测抗M3受体胞外区第一环多克隆抗体；步骤4.用细胞免疫荧光法检测抗M3受体胞外区第一环多克隆抗体。本发明专利技术通过用M3R整个胞外区免疫C57BL/6J小鼠，发现经免疫后小鼠体内出现了抗M3R第一环抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗体的制备方法，具体地说，涉及。
技术介绍
干燥综合征(sjogren’ s syndrome, SS)是一种系统性自身免疫性疾病。临床上主要以淋巴细胞浸润外分泌腺(如涎腺和泪腺)为特征，表现为唾液腺、泪腺及消化道等外分泌腺体功能失调，导致进行性口干、眼干及内脏受累。由于唾液、泪腺分泌减少或停止，出现口、眼干燥难忍、口唇破裂、龋齿猖獗或反复角膜炎、结膜炎、腮腺肿大及血管炎等。重症患者可有肺间质纤维化、肺动脉高压、肾小管酸中毒及中枢神经系统受累等严重内脏病变。干燥综合征患者中淋巴瘤、骨髓瘤等恶性肿瘤的发生率是正常人的40倍。流行病学调查发现，本病在我国的患病率为0.77%，而在50岁以上人群中的患病率达5%。总患病人数逾800万，其中大部分患者未得到及时的诊断和治疗。干燥综合征的发病机制尚不十分清楚。研究发现，患者血清中可含有抗核抗体、抗SSA及SSB等多种自身抗体，唇黏膜活检可见大量淋巴细胞浸润。近20年来，国内外的大量工作致力于寻找及研究干燥综合征的致病性抗原，但并无明显进展。抗核抗体(ANA)JASSA及抗SSB抗体等虽见于干燥综合征患者，但亦见于系统性红斑狼疮等其他自身免疫病，对干燥综合征并不具特异性。因此，发现并研究干燥综合征的特异性或相对特异性抗原对认识本病的发生机制及免疫治疗有重要意义。M受体(Muscarinic Acethylcholine Receptor)即毒蕈喊样乙酰胆喊受体是胆喊能受体的一种，它位于副交感神经节后纤维所支配的效应器细胞膜上，对以毒蕈碱为代表的拟胆碱药较为敏感。研究发现，主要分布于外分泌腺及平滑肌的M3受体能利用信号转导通路调节腺体的分泌，使膀胱逼尿肌及睫状肌的收缩、稳定自主神经功能；而这些功能的失调与干燥综合征的临床症状相近似。近年来，M3受体与干燥综合征的关系已逐渐得到风湿病专家的广泛关注。Yamamoto等研究发现患病NOD鼠的血清可以与同位素标记的M3受体发生免疫沉淀反应，提示病鼠体内存在抗M3受体的抗体。Robinson等研究基因敲除后的NOD Ig null鼠(SS鼠)时注意到，用M3受体激动剂毛果芸香碱(Pilocarpine)刺激NOD Ig null鼠后，其腺体分泌可恢复正常；而SS患者或病鼠血清中的IgG可以抑制其对腺体分泌的刺激作用；但如果事先用大鼠腮腺细胞吸附SS患者血清中的IgG，则这种抑制作用消。这些现象均说明SS患者血清或病鼠体内存在抗M3受体的抗体，而且该抗体很可能是导致干燥综合征发生的重要致病因素。NOD-scid为另一种基因敲除的NOD鼠，Nguyen等将抗M3受体抗体和抗SSB抗体(目前认为与SS有关的抗体)注入免疫缺陷NOD-scid鼠的腹腔后发现，只有抗M3受体抗体可以引起干燥综合征样的体分泌功能减低，而其他抗体没有这种作用。这个结果再次证明是体液免疫而不是细胞毒或细胞因子的作用产生了干燥综合征样的临床表现，而且抗M3受体抗体对外分泌腺分泌功能有特异性抑制作用。Bacman等在间接免疫荧光试验中发现原发性SS患者血清可以与大鼠眶外泪腺腺泡细胞作用，使后者产生膜表面均匀一致的荧光，M3受体细胞外第二环的合成多肽可以抑制这种荧光，提示SS患者体内同样存在着抗M3受体抗体。以人工合成的M325肽及鼠眶外泪腺腺泡细胞膜提取物为抗原，用ELISA法先后测定了干燥综合征患者唾液中的IgA及血清中的IgG，结果均显示干燥综合征患者的唾液及血清中确实存在着抗M3受体抗体，而且该抗体可以与M3受体合成多肽相结合。Bacman等在其进行的一系列实验后指出抗M3受体抗体在干燥综合征患者血清中的敏感性为80% -90%，特异性为90%，而且该抗体的存在与是否存在干燥综合征的其他自身抗体如抗SSA、SSB抗体等无关。Naito等用在体外培养的干燥综合征患者外周血T细胞中加入人工合成的M3受体细胞外第二环多肽，发现T细胞分泌γ干扰素减少，提示特异性多肽可以减少外周血中抗M3受体抗体对T细胞的刺激作用。目前研究发现毒蕈碱3(M3)受体与干燥综合征的发病有密切的关系，在SS患者及干燥综合征动物模型中也相应检测到了抗M3受体的抗体，该抗体可以阻断正常的乙酰胆碱对M3受体的激活作用，干扰信号传导，导致唾液、泪液分泌减少。Dawson等的研究发现M3受体可能参与了干燥综合征患者免疫球蛋白G的抗分泌作用。而抗M3受体抗体则能抑制Ca2+转导信号，从而抑制M3受体对唾液腺分泌的激活作用，但这种作用是可逆的。近年来，对M3受体、抗M3受体抗体与SS关系的研究表明，抗M3受体抗体在SS诊断中具有重要的意义，它的敏感性为86.00%，特异性为96.30%，均明显高于目前已知的与SS有关的其他自身抗体。在抗SSA、SSB抗体阴性的患者中，抗M3受体抗体的阳性率分别为81.00%,87.50%,提示抗M3受体抗体在SS的诊断中可以弥补其他抗体的不足，特别是对抗SSA抗体阴性SS患者的诊断更有意义。M3R 的胞外区第二环(LFWQYFVGKRTVPPGECFIQFLSEPT)和第三环(NTFOTSCIPKTFWN)被认为是受体与配体结合的主要区域，近年来对于M3R受体的研究也主要集中在这这两个结构域。而国内外对于M3R胞外区第一环的研究很少。在干燥综合症患者中，只有Tshboi的研究表示有47.6%的患者有第一环的自身抗体。而在实验动物中，目前尚无对M3R第一环的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供，该方法通过用M3R整个胞外区免疫C57BL/6J小鼠，发现经免疫后小鼠体内出现了抗M3R第一环抗体。其具体技术方案为:，包括以下步骤:步骤1:多肽合成；步骤2.用M3受体胞外区免疫C57/B6小鼠；步骤3.ELISA方法检测抗M3受体胞外区第一环多克隆抗体；步骤4.用细胞免疫荧光法检测抗M3受体胞外区第一环多克隆抗体。进一步，步骤2具体包括以下步骤:I)使用的小鼠为C57/B6小鼠，购自维通利华公司，24只，雌性，6周龄；2)动物分组:共分4组；4组分别是第一环组，胞外区组，对照肽组和PBS组；3)动物免疫方法:4组小鼠在第8周同时进行第一次免疫；多肽用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为2mg/ml，将溶解后的多肽以1:1的比例与完全弗氏佐剂混合充分研磨后皮下免疫小鼠，每只小鼠免疫10ug多肽；4组小鼠在第9周时第一次注射脂多糖；脂多糖用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为lmg/ml，每只小鼠注射50ug ；4组小鼠在第11周同时进行第二次免疫；多肽用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为2mg/ml，将溶解后的多肽以1:1的比例与不完全弗氏佐剂混合充分研磨后皮下免疫小鼠，每只小鼠免疫10ug多肽；4组小鼠在第12周时第二次注射脂多糖；脂多糖用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为lmg/ml，每只小鼠注射50ug ；4组小鼠在16周进行第3次免疫，方法同第二次；4组小鼠在17周进行脂多糖注射，方法同第二次。进一步，步骤3具体包括以下步骤:I)以50 μ I 0.1M NaHCO3,pH 8.6，包被1yg M3受体整个胞外区蛋白，第一环多肽，对照多肽于96孔板，置湿盒中，4°C过夜；2)倾去包被液，倒扣于干净滤纸上，加入封闭缓冲液10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗毒蕈碱3型受体第一环抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：：多肽合成；步骤2.用M3受体胞外区免疫C57/B6小鼠；步骤3.ELISA方法检测抗M3受体胞外区第一环多克隆抗体；步骤4.用细胞免疫荧光法检测抗M3受体胞外区第一环多克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王永福，白力，杨麟，
申请(专利权)人：内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。