缀合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种缀合物，包括融合蛋白和标记物，融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，标记物标记在辅助蛋白上。这种缀合物中，辅助蛋白嵌合在梅毒检测抗原的N端，标记物标记在辅助蛋白上，避免了标记物与抗原直接作用。与传统的试剂相比，该缀合物随标记比例提高，抗原不会被标记物包裹，避免了抗原决定簇与标记物结合造成的抗原活性降低，从而不会影响抗原活性，检测时可适当提高标记物的比例，进而提高检测的灵敏度和特异性。本发明专利技术还公开了上述缀合物的制备方法及应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫检测领域，特别是涉及一种。
技术介绍
梅毒是一种慢性系统性传染病，其病原体是梅毒螺旋体，亦称苍白螺旋体 (Treponema pallidum, TP)，主要通过性接触和血液传播。梅毒可产生多种多样的症状和体 征，且时隐时显，病程可持续很长，几乎可侵犯全身各器官，是仅次于艾滋病的严重危害我 国人民身体健康的性传播疾病。近年来梅毒发病率在我国有上升的趋势，据2014年梅毒重 点疫情报告，2009年以来梅毒位于乙类传染病报告发病数的第三，尤其是在产前门诊筛查 出的梅毒抗体阳性的孕妇显著增加，给我国的公共卫生带来危害。 目前，国内外对梅毒的发病机制和诊断方式进行了大量的研究，梅毒的诊断和治 疗后效果评价一直是利用体液免疫学指标。我国对血源筛选部分采用快速血浆反应素环 状卡片试验（rapid plasma reagin，RPR)和甲苯胺红不加热血清试验（tolulized red unheated serum test, TRUST)方法，RPR和TRUST的主要缺点是敏感性和特异性不高，许多 非梅毒性疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性迀延性肝炎等均可呈阳性反应。 另外一种方法，荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验和梅毒螺旋体血凝试验虽然可提高检测的特 异性，但是需制备大量病原体，且质量难以控制，也不利于大规模的血液筛查工作。因此，研 制快速、简便、灵敏且特异的诊断试剂是当前的主要任务。 免疫检测（immunoassay, IA)是应用免疫学技术测定标本，通过抗原抗体反应检 测体液中的抗体或抗原性物质，是一种敏感的测定的方法。抗原抗体反应后直接测定形成 的沉淀或浊度，敏感度可达5-10 iig/mL。但在临床检验中，某些待测物在标本中的含量远低 于这一水平，导致检测受限。目前市场上大多梅毒检测产品采用标记法，将检测试剂中的抗 原或抗体用可微量测定的物质加以标记，通过测定标记物可提高敏感度。标记物有多种，包 括酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质等，均可提高免疫检测的灵敏度，比直接测定沉 淀物提高数百至数千倍，达到肉眼可分辨的水平或者机器可读出的水平。在免疫检测时，为 了提高灵敏度，标记比例越高越好，但是，标记比例提高会影响抗原活性。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种标记比例提高并且不影响抗原活性的缀合物，以及其制 备方法和应用。 一种缀合物，其特征在于，包括融合蛋白和标记物，所述融合蛋白包括梅毒检测抗 原以及嵌合在所述梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，所述标记物标记在所述辅助蛋白上。 在一个实施例中，所述梅毒检测抗原为梅毒螺旋体抗原。 在一个实施例中，所述辅助蛋白为大肠杆菌周质蛋白。 在一个实施例中，所述大肠杆菌周质蛋白包括： (a)、由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽； (b)、与SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90%同源性的多 核苷酸编码得到的多肽；或 (c)、由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被 缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。 在一个实施例中，所述大肠杆菌周质蛋白包括：(a)、由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、与SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90%同源性的多肽； 或 (c)、由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺 失、替代或增加得到的多肽。 在一个实施例中，所述标记物为酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质和胶体 中的至少一种。 -种上述缀合物的制备方法，包括如下步骤： 步骤一、提供基因表达载体，所述基因表达载体用于表达融合蛋白，所述融合蛋白 包括梅毒检测抗原以及嵌合在所述梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白； 步骤二、将所述基因表达载体转化到宿主细胞中，所述宿主细胞为原核细胞； 步骤三、对转化了所述基因表达载体的所述宿主细胞进行诱导表达，分离得到表 达液； 步骤四、在所述表达液中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20%，充分静止后 收集上清，接着在所述上清中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为40%，充分静止后收集 沉淀，将所述沉淀重新溶解，得到粗产物； 步骤五、利用Ni-NTA亲和柱纯化所述粗产物，得到所述融合蛋白； 步骤六、对所述融合蛋白进行标记，使得标记物标记在所述辅助蛋白上，得到所述 缀合物。 -种梅毒检测试剂，包括上述缀合物。 -种梅毒检测试剂盒，包括上述梅毒检测试剂。 上述缀合物在制备梅毒诊断试剂领域中的应用。 这种缀合物中，辅助蛋白嵌合在梅毒检测抗原的N端，标记物标记在辅助蛋白上， 避免了标记物与抗原直接作用。与传统的试剂相比，该缀合物随标记比例提高，抗原不会被 标记物包裹，避免了抗原决定簇与标记物结合造成的抗原活性降低，从而不会影响抗原活 性，检测时可适当提尚标记物的比例，进而提尚检测的灵敏度和特异性。【附图说明】 图1为一实施方式的缀合物的制备方法的流程图； 图2为一实施方式的基因表达载体的构建过程。【具体实施方式】 下面主要结合附图及具体实施例对做进一步的解释 说明。 本专利技术中使用的术语除非另有说明，否则具有以下含义： 缀合物 本专利技术中使用的术语"缀合物"包括融合蛋白和标记物，融合蛋白包括梅毒检测抗 原以及嵌合在梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，标记物标记在辅助蛋白上。 融合蛋白 本专利技术中使用的术语"融合蛋白"是指辅助蛋白嵌合在梅毒检测抗原的N端形成 的蛋白。 标记物 本专利技术中使用的术语"标记物"是指免疫检测中可被检测到的物质，具体的，标记 物可以为酶、化学发光物质、荧光物质、放射性物质、胶体中的至少一种。 在传统的免疫检测时，由于标记物直接标记在抗原上面，其存在的固有缺陷是：为 了提高灵敏度，标记比例越高越好，但是比例过高会使抗原被更多的标记物包裹，抗原表位 被包埋，导致抗原活性降低，因此为了兼顾抗原活性标记比例无法无限制提高，造成灵敏度 提高有限。本专利技术发现，在梅毒检测抗原的N端嵌合辅助蛋白可以有效的解决上述问题。 因此，本专利技术提供一种缀合物，包括融合蛋白和标记物，融合蛋白包括梅毒检测抗 原以及嵌合在梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，标记物标记在辅助蛋白上。 缀合物中的标记物标记在辅助蛋白上，避免了标记物与抗原直接作用，因此不会 影响抗原活性，检测时可适当提高标记物的比例，进而提高检测的灵敏度和特异性。 具体的，梅毒检测抗原可以为梅毒螺旋体抗原。在一个实施方式中，梅毒检测抗原 为梅毒螺旋体 17Kda(TpN17)基因（GeneBank No :M74825)的 63aa ~156aa 所对应的 DNA 区段表达得到的梅毒螺旋体抗原。 在其他实施方式中，梅毒检测抗原还可以选择其他种类的梅毒螺旋体抗原。 具体的，辅助蛋白可以为大肠杆菌周质蛋白。 大肠杆菌周质蛋白（0SMY)能促进蛋白溶解性及细胞定位，而周质中的氧化环境 有利于蛋白质的正确折叠，明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。通过梅毒螺旋体抗原 与大肠杆菌周质蛋白融合表达，得到的融合蛋白可溶性增强，蛋白活性高。另外，经分子生 物学软件分析，0SMY等电点为酸性，亲水性较好，赖氨酸含量较高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缀合物，其特征在于，包括融合蛋白和标记物，所述融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在所述梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，所述标记物标记在所述辅助蛋白上。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范凌云，孟媛，李泓彦，
申请(专利权)人：菲鹏生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44