本发明专利技术公开一种SD大鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：1）在无菌条件下切取SD大鼠的颈总动脉；2）将颈总动脉切割成段后放入PBS溶液中，剥除外膜，并将颈总动脉沿纵向切割，把内膜向下平摊于装有消化酶溶液的容器内，使颈总动脉的内膜与容器中的消化酶溶液充分接触；3）振动容器，使内皮细胞脱落，消化结束后除去颈总动脉，向容器中加入胎牛血清，搅拌均匀后制得混合液；4）将混合液离心，除去上清液后得到颈总动脉内皮细胞，将颈总动脉内皮细胞放入内皮细胞培养基中进行培养，达到对数期后转入培养箱中培养，之后进行传代培养。本发明专利技术不仅成活率高、对细胞损害低，且经济实用、简单易行，适于工厂等大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种SD大鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法。
技术介绍
血管内皮细胞具有多种生理功能，能产生和分泌许多生物活性物质，在维持血管舒缩，抗凝血等方面起重要作用。体外血管内皮细胞的成功培养是研究内皮细胞功能及其在各种疾病发生发展中所起作用的基础。从实验用SD大鼠颈总动脉分离得到的内皮细胞(endothelial cell, EC)是广泛用于实验研究的血管内皮细胞。内皮细胞体外生长能力较差，原代培养不易成功。以往主要是采用机械分离法和组织块移植法。将脐静脉剪开，用手术刀背等刮取内皮细胞或使用带有尼龙筛的分离管，但这一方法很难掌握力度，用力太轻，取得的细胞数量很少；用力太重，易混杂其他血管壁细胞如成纤维细胞等，而且此方法易损伤内皮细胞。近几年来内皮细胞分离已逐渐被酶消化法取代，此法获得的细胞较纯，且能较好地保持其生物活性，但是胰酶对细胞膜有较强的分解能力，能够破坏细胞的完整性，影响细胞的活力，并且消化所得的内皮细胞中，可能含有大量的成纤维细胞，对后续实验产生影响，胶原酶消化时间长，细胞解离不充分且损伤大，另外所得细胞极少，培养时细胞活性差。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种SD大鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，不仅成活率高、对细胞损害低，而且经济实用、简单易行，适于工厂等大规模生产。本专利技术为解决上述问题所采取的技术方案是:一种SD大鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，包括以下步骤: 1)选取重为100-150g的SD大鼠，在无菌条件下切取SD大鼠的颈总动脉并除去血污，备用; 2)将颈总动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，剥除颈总动脉的外膜，并将颈总动脉沿纵向切割，把颈总动脉的内膜向下平摊于装有消化酶溶液的容器内，使颈总动脉的内膜与容器中的消化酶溶液充分接触，实现颈总动脉内膜的消化，所述消化酶溶液由质量浓度为0.2%的I型胶原酶和质量浓度为0.125%的胰酶按1:1的体积比混合并搅拌均勾后制得； 3)在颈总动脉内膜消化的过程中振动容器，使内皮细胞脱落，消化结束后除去颈总动脉，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清与容器中液体的体积比为1-2:2，搅拌均匀后制得混合液； 4)将混合液放入转速为1500r/min的离心机中离心3min，除去上清液后得到颈总动脉内皮细胞，将颈总动脉内皮细胞放入内皮细胞培养基中进行培养，达到对数期后转入温度为37°C、CO2体积浓度为5%的CO 2培养箱中培养，之后进行传代培养即可。进一步优化，步骤2)所述消化的温度为37°C、时间20min。所述SD大鼠颈总动脉内皮细胞的传代方法，包括了以下步骤: A、把步骤4离心得到的SD大鼠颈总动脉内皮细胞放入温度为37°C的CO2培养箱中培养24小时，然后倒掉培养基，并用无菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去红细胞和死细胞； B、将步骤A处理后的SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入EBM培养基中培养，每隔2-3天换一次培养基，培养4-6天后除去培养基，并用无菌PBS溶液清洗，备用； C、将SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入消化液中进行消化反应，待细胞变圆后除去消化液，并加入胎牛血清以终止消化反应； D、将完成消化反应的SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入离心管中，在转速为1500rpm的离心机中离心3min，除去上清液后，将沉淀加入到DMHM培基中培养即可。进一步优化，步骤C中所述的消化液是将质量浓度为0.125 %的胰酶和质量浓度为0.02%的EDTA按6:1的体积比混合并搅拌均匀后制得。有益效果 本专利技术采用SD大鼠为材料，材料来源广泛，方便易得。采用胰酶和胶原酶联合消化的方法分离得到内皮原代细胞，克服了两种酶的各自缺点，可获得较高的细胞存活数量。选择37°C为消化条件，两种酶活性最高，消化效果最佳，对内皮细胞的消化能力较强。两种酶按1:1混合，对内皮细胞的损害较小，分离出的血管内皮细胞数量多，杂细胞污染少，细胞贴壁能力强。此方法经济实用，简便易行，有利于获得所需的体外实验模型细胞，为进一步研究内皮细胞在提高心血管疾病药物药效方面提供帮助。【附图说明】图1为内皮细胞培养过程中形态观察结果； 图2为内皮细胞VIII因子免疫组化结果； 图3为丹参注射液对血管内皮细胞作用的MTT检测存活率图。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明，本专利技术的保护范围不限于下述实施例。一种SD大鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，包括以下步骤: 1)选取重为100-150g的SD大鼠，在无菌条件下切取SD大鼠的颈总动脉并除去血污，备用; 2)将颈总动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，剥除颈总动脉的外膜，并将颈总动脉沿纵向切割，把颈总动脉的内膜向下平摊于装有消化酶溶液的容器内，使颈总动脉的内膜与容器中的消化酶溶液充分接触，实现颈总动脉内膜的消化，所述消化酶溶液由质量浓度为0.2%的I型胶原酶和质量浓度为0.125%的胰酶按1:1的体积比混合并搅拌均勾后制得； 3)在颈总动脉内膜消化的过程中振动容器，使内皮细胞脱落，消化结束后除去颈总动脉，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清与容器中液体的体积比为1-2:2，搅拌均匀后制得混合液； 4)将混合液放入转速为1500r/min的离心机中离心3min，除去上清液后得到颈总动脉内皮细胞，将颈总动脉内皮细胞放入内皮细胞培养基中进行培养，达到对数期后转入温度为37°C、CO2体积浓度为5%的CO 2培养箱中培养，之后进行传代培养即可。所述SD大鼠颈总动脉内皮细胞的传代方法，包括了以下步骤: A、把步骤4离心得到的SD大鼠颈总动脉内皮细胞放入温度为37°C的CO2培养箱中培养24小时，然后倒掉培养基，并用无菌PBS溶液中清洗2-3次，以除去红细胞和死细胞； B、将步骤A处理后的SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入EBM培养基中培养，每隔2-3天换一次培养基，培养4-6天后除去培养基，并用无菌PBS溶液清洗，备用； C、将SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入消化液中进行消化反应，待细胞变圆后除去消化液，并加入胎牛血清以终止消化反应； D、将完成消化反应的SD大鼠颈总动脉内皮细胞转入离心管中，在转速为1500rpm的离心机中离心3min，除去上清液后，将沉淀加入到DMHM培基中培养即可。步骤2)所述消化的温度为37°C、时间20min。步骤C中所述的消化液是将质量浓度为0.125%的胰酶和质量浓度为0.02%的EDTA按6:1的体积比混合并搅拌均匀后制得。实施例1 一种SD大鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，包括以下步骤: 1)选取重为100-150g的SD大鼠，在无菌条件下切取SD大鼠的颈总动脉并除去血污，备用; 2)将颈总动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，剥除颈总动脉的外膜，并将颈总动脉沿纵向切割，把颈总动脉的内膜向下平摊于装有消化酶溶液的容器内，使颈总动脉的内膜与容器中的消化酶溶液充分接触，实现颈总动脉内膜的消化，所述消化酶溶液由质量浓度为0.2%的I型胶原酶和质量浓度为0.125%的胰酶按1:1的体积比混合并搅拌均勾后制得； 3)在颈总动脉内膜消化的过程中振动容器，使内皮细胞脱落，消化结束后除本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种SD大鼠颈总动脉内皮细胞的分离和培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1）选取重为100‑150g的SD大鼠，在无菌条件下切取SD大鼠的颈总动脉并除去血污，备用；2）将颈总动脉切割成长为3‑5cm的长段后放入PBS溶液中，剥除颈总动脉的外膜，并将颈总动脉沿纵向切割，把颈总动脉的内膜向下平摊于装有消化酶溶液的容器内，使颈总动脉的内膜与容器中的消化酶溶液充分接触，实现颈总动脉内膜的消化，所述消化酶溶液由质量浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶和质量浓度为0.125%的胰酶按1:1的体积比混合并搅拌均匀后制得；3）在颈总动脉内膜消化的过程中振动容器，使内皮细胞脱落，消化结束后除去颈总动脉，向容器中加入胎牛血清，且胎牛血清与容器中液体的体积比为1‑2:2，搅拌均匀后制得混合液；4）将混合液放入转速为1500r/min的离心机中离心3min，除去上清液后得到颈总动脉内皮细胞，将颈总动脉内皮细胞放入内皮细胞培养基中进行培养，达到对数期后转入温度为37℃、CO2体积浓度为5%的CO2 培养箱中培养，之后进行传代培养即可。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王燕华，武福华，王小立，王保平，郭昭涵，张乃群，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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