本发明专利技术公开一种基于氟代核酸探针的双通道传感器检测急早幼粒PML/RARα基因序列的方法，包括如下步骤：根据所选择的待检测APL基因型别通用引物序列的融合位点，对APL的特异性序列进行设计及合成两组特异性的2’-氟代RNA单体修饰探针；采用2’-氟代RNA单体修饰探针技术与电化学酶联放大技术实现同时检测APL的 PML/RARα融合基因双链DNA中的两条互补链。采集两组探针与相对应的互补链杂交后催化产生的电流信号并进行计算处理，可定量检测靶标 dsDNA。实现了对急性早幼粒细胞白血病的早期诊断，同时也有望应用于其它疾病相关基因dsDNA 的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于氟代核糖核酸双探针的双通道电化学传感器检测急性早幼 粒细胞白血病双链PML/RARa融合基因序列的方法，属于生物传感
技术介绍
急性早幼粒细胞白血病（APL)是急性髓细胞白血病（AML) FAB分型中的M3亚型，是 严重危害人类健康的恶性血液病之一。它起病急，迅速恶化，表现十分凶险，出血倾向明显， 易发生弥漫性血管内凝血，死亡率高，治疗比较困难。白血病早期诊断（基因诊断）水平将 直接影响患者的治疗效果及生存质量，其重要意义不言而喻。 目前临床上常用的检测方法主要有流式细胞技术、FISH技术、染色体分析法、 RT-PCR技术等，但都存在一定的局限性，如价格昂贵、操作繁琐、灵敏度不高等。因此，研发 一种尚敏感性、尚选择性的APL相关基因的检测技术具有极其广阔的临床应用如景。 APL最为常见的染色体易位为t (15 ; 17) (q22 ;q21)，其易位产物PML/RARa融合 基因发生于95%的APL中，是恶性克隆的标志基因。 临床样品中，待测DNA通常以双链大片段形式存在，双链片段中与靶标ssDNA互 补的另一条DNA序列容易对DNA探针分子的检测造成干扰。利用单通道电化学DNA生物 传感器检测基因序列，其单探针捕获靶标dsDNA的过程存在干扰分子识别及降低杂交效率 等不足。因此，为解决单通道电化学DNA生物传感器的局限性，对原有单组DNA探针分子 进行优化，设计了基于双组探针检测的新型传感检测方法，即将两组分别与待测靶标dsDNA 两条序列部分互补的捕获探针修饰在双通道电化学DNA阵列传感器不同通道的电极表面， 通过双通道电化学阵列传感器实现对靶标dsDNA两条序列的同时检测，有利于提高探针与 dsDNA的杂交效率，有助于阵列传感器日后实现对临床实际样品中dsDNA的直接检测。 DNA探针分子作为多通道电化学DNA阵列传感器设计的关键，其与待测靶标DNA 之间的序列选择性对DNA阵列传感器的性能具有很大的影响，而经典传感器中，所设计 的ssDNA探针多数存在稳定性差的问题。所以，研制高灵敏度和高特异性的DNA探针，并 将其应用于与靶标DNA序列间杂交信息的检测具有重要意义。2' -氟代核糖核酸单体 (2' -fluoro RNA monomers, 2' -F RNA)作为一种新型的寡核酸衍生物，是通过氟元素取代 核糖C2'位的羟基，加固了 C3'内型的N构型，使得核糖结构的柔韧性降低，进而增强了磷 酸盐骨架局部结构的稳定性。正是因为这样的结构特点，使得2-F RNA具有抗脱氧核苷酸 酶降解的特性，同时对DNA、RNA也有很好的亲和力，且其与DNA、RNA进行杂交后所形成的双 螺旋结构具有更好的稳定性，序列中每增加一个2' -氟代RNA单体修饰，即可使解链温度 (Tm)值升高1~2°C，利用这一特性有助于实现提高探针序列对非靶标序列的错配识别能 力。 下面所述的为本专利技术人率先将基于2'-氟代RNA单体修饰双探针的电化学酶链放 大检测方法应用于快速检测PML/RAR a融合基因 dsDNA片段：本实验针对APL中PML/RAR a 融合基因的相关碱基序列，设计了两组2'-F RNA单体修饰探针（包含了捕获探针和报告探 针），与酶联放大技术相结合构建一种新型的"三明治"构型双通道电化学DNA阵列传感模 式，并将其用于人工合成的PML/RARa融合基因 dsDNA的检测。 该传感模式包含有两组检测探针，每组探针各包含有一条3'端修饰巯基的捕 获探针（Capture probe,以下简称C)和一条5'端修饰有生物素的报告探针（Reporter probe，R)，且这两组探针（以下简称C1/R1和以下简称C2/R2)分别与靶标dsDNA中相应的 两条ssDNA(以下简称Sa和Sb)部分基因序列存在互补。其中，修饰有巯基的捕获探针（以 下简称Cl和C2)能够通过自组装分别固定到不同的工作电极表面，而过量的报告探针（以 下简称Rl和R2)则提前加入到含有待测靶标dsDNA的杂交溶液中进行热变性后置于冰浴 中以确保杂交液中的DNA序列均保持ssDNA状态，并将修饰了 Cl和C2的两个金电极工作 电极放入含有报告探针Rl、R2和祀标dsDNA的待测溶液中进行杂交反应。通过杂交反应， 在两个工作电极表面形成了"三明治"传感模式。此时生物素已通过杂交修饰到电极表面， 亲和素修饰的辣根过氧化物酶可以与生物素相互识别，将辣根过氧化物酶结合到工作电极 上。最后，可将工作电极置于由3,3'，5,5'_四甲基联苯胺（TMB)和H 2O2组成的检测底液， 通过HRP催化使得H2O2氧化TMB产生电化学信号，利用双通道电化学工作站进行信号采集。 若溶液中不含靶标dsDNA，则杂交反应无法进行，工作电极界面上无法形成"三明治"构型传 感模式，那么HRP也就无法固定到电极表面，电极无法对检测底液进行催化，所以双通道电 化学工作站检测到的电流信号很弱。通过对双通道所采集到的电流信号进行处理，比较其 最终结果的信号变化就可以说明杂交反应是否进行，溶液中是否含有靶标dsDNA。该传感模 式通过修饰有2'-F RNA的DNA检测探针和酶的催化功能，极大地增强了该检测方法测定双 链DNA的特异性及灵敏度，从而建立了高灵敏度、高特异性的急性早幼粒细胞白血病基因 检测方法，应用于有效解决急性早幼粒细胞白血病早期诊断这一临床迫切的实际问题，无 疑具有极其重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于氟代核糖核酸双探针的双通道电化学传感器及 其检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的方法，旨在解决临床实际样品 中DNA多以双链片段形式存在，双链片段中与靶标单链DNA相互补的另一条DNA链容易对 探针的检测造成干扰，影响检测效果，且现有检测方法灵敏度低、检测周期长、价格昂贵等。 本专利技术的目的是这样实现的，本专利技术所述的基于2' -氟代核糖核酸双探针的双通 道电化学传感器，包含有两组检测探针，其特征在于每组探针包含有一条3'端修饰巯基的 捕获探针和一条5'端修饰有生物素的报告探针，且这两组探针分别与靶标急性早幼粒细 胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA中相应的两条ssDNA部分基因序列存在互补；其中， 两个修饰有巯基的捕获探针能够通过自组装相应固定到位于两个通道上的两个具有型号 相同的金电极工作电极表面上，在两个金电极工作电极表面未结合的位点通过封闭剂进行 封闭，而过量的报告探针则提前加入到含有待测靶标dsDNA的杂交溶液中进行热变性后置 于冰浴中以确保杂交液中的DNA序列均保持ssDNA状态，并将一组中的修饰有巯基的一条 捕获探针的金电极工作电极和另一组中的修饰有巯基的另一条捕获探针的金电极工作电 极一同放入含有一条5'端修饰有生物素的报告探针、另一条5'端修饰有生物素的报告探 针和靶标急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的待测溶液中进行杂交反应， 通过杂交反应，在两个金电极工作电极表面形成了 "三明治"传感模式，此时生物素已通过 杂交修饰到电极表面，加入亲和素修饰的辣根过氧化物酶与生物素相互识别，将辣根过氧 化物酶结合到金电极工作电极上；所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于2’‑氟代核糖核酸双探针的双通道电化学传感器，包含有两组检测探针，其特征在于每组探针包含有一条 3’ 端修饰巯基的捕获探针和一条 5’ 端修饰有生物素的报告探针，且这两组探针分别与靶标急性早幼粒细胞白血病 PML/RARα融合基因 dsDNA 中相应的两条 ssDNA部分基因序列存在互补；其中，两个修饰有巯基的捕获探针能够通过自组装相应固定到位于两个通道上的两个具有型号相同的金电极工作电极表面上，在两个金电极工作电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭，而过量的报告探针则提前加入到含有待测靶标 dsDNA 的杂交溶液中进行热变性后置于冰浴中以确保杂交液中的 DNA 序列均保持 ssDNA 状态，并将一组中的修饰有巯基的一条捕获探针的金电极工作电极和另一组中的修饰有巯基的另一条捕获探针的金电极工作电极一同放入含有一条5’ 端修饰有生物素的报告探针、另一条5’ 端修饰有生物素的报告探针和靶标急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因dsDNA 的待测溶液中进行杂交反应，通过杂交反应，在两个金电极工作电极表面形成了“三明治”传感模式，此时生物素已通过杂交修饰到电极表面，加入亲和素修饰的辣根过氧化物酶与生物素相互识别，将辣根过氧化物酶结合到金电极工作电极上；所述的金电极工作电极置于由 3，3’，5，5’‑ 四甲基联苯胺和 H2O2 组成的检测底液中，通过辣根过氧化物酶 HRP 催化使得 H2O2 氧化 TMB 产生电化学信号，利用双通道电化学工作站进行信号采集，当溶液中不含靶标 dsDNA时，则杂交反应无法进行，金电极工作电极界面上无法形成“三明治”构型传感模式，那么辣根过氧化物酶 HRP 也就无法固定到金电极工作电极表面上，金电极工作电极无法对检测底液进行催化，所以双通道电化学工作站检测到的电流信号很弱，通过对双通道所采集到的电流信号进行处理，比较所采集到的电流信号变化就能说明杂交反应是否进行，溶液中是否含有靶标 dsDNA。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林新华，刘爱林，王昆，陈元仲，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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