本发明专利技术涉及一种脂肪酶抑制剂的筛选方法和应用，该方法系柱前反应测定方法，在水浴中用酶催化水解底物，然后在紫外214nm处直接测定产物峰面积实现酶活的测定和酶抑制剂的筛选方法；该方法不仅具有简便、重复性好、试剂消耗少、准确性高的优点，而且适用于脂肪酶抑制剂的筛选和分析，尤其适用于如中药粗提液等混合化合物样品中脂肪酶抑制剂的筛选且为快速筛选发现治疗肥胖症药物奠定理论基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶抑制剂筛选方法，特别涉及的是脂肪酶抑制剂的筛选方法和应用， 可以用于中药粗提物、海洋药物标准组分和小分子化合物的筛选等方面。
技术介绍
威胁人类健康的疾病大都被发现与相关酶的失调密切联系，因此酶是目前新药研 制的重要靶标。据统计，酶抑制剂类药物约占目前整个药物市场份额的47%。对于酶抑制 剂类药物的开发来讲，发现新的对靶标酶有抑制活性的酶抑制剂化合物是药物开发初期的 主要任务。现在，虽然可以通过组合化学合成和天然产物提取的方式得到成千上万的化合 物，但如何快速地从这数量巨大的化合物库中筛选出有活性的药物先导化合物仍然是新药 开发的瓶颈。据世界卫生组织的统计，肥胖症是人类目前面临的最容易被忽视、但发病率却 在急剧上升的一种慢性疾病。全球大约有11亿成年人和10%的儿童体重超重或患有肥胖 症。肥胖症还会导致多种慢性疾病的发生，因此如何有效地减少肥胖成为了许多国家面临 的重要研究课题。脂肪酶是用来消化包括三酯酰甘油以及磷酸酯等脂肪的酶类。它在三酯 酰甘油的消化中发挥关键作用。通过抑制脂肪酶的活性可以有效地抑制肠道中脂肪酶对脂 肪的分解催化作用，可以达到减少脂肪吸收、控制和治疗肥胖的作用。因此，以脂肪酶为靶 点，筛选脂肪酶抑制剂，是研究和开发治疗肥胖症药物的一个重要途径。酶筛选模型是分子水平筛选模型中的一种，因其具有耗材量少、药物作用机制明 确、筛选规模大等优点，在药物筛选领域引起人们极大的关注。在传统的以酶为靶点的抗 脂肪酶活性筛选方法中，大都采用在一定条件下令酶和底物反应，待反应终止后利用紫 外-可见分光光度法或荧光法来检测产物，通过计算待筛样品加入前后吸收度的变化得到 抑制剂的抑制率。该方法突出的优点是设备简单易于推广，但缺点是人工操作、费时且需要 酶的量较大、对复杂样品进行筛选时基体干扰最终的观测，不适合用来筛选成分复杂的天 然产物组分。毛细管电泳（CE)作为继HPLC之后又一强有力的分离分析方法，具有高的分离效 能和灵活多样的分离方式，有望成为药物筛选多样化的新平台。在酶抑制动力学关系研 究方面，尤其在成分复杂的中草药有效成分的抑制作用研究中，以其良好的分离效果、快 速、简便、柱不易受污染的特点，被广泛用于酶抑制剂筛选抑制活性评估及抑制类型判断 等方面，CE技术已成为研究酶反应、酶动力学，以及发现潜在酶抑制剂的有效手段。柱前 反应测定是用CE进行酶测定的最常用方法，将酶与底物混合一段时间，使酶促反应充分 发生，然后注入到毛细管中，继而进行电泳分离和定量测定。这种方法能够用最少的样品 和最短的处理时间尽快给出底物和产物的出峰时间信息。在以前的研究中，我们课题组 建立了中草药粗提物中a-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制剂的CE筛选方法，（T. -F. Jiang， T. -T. Liang, Y. -H. Wang，Z. -H. Lv. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2013, 84: 36-40. L.-P. Guo, T.-F. Jiang, Z.-H. Lv, Y.-H. Wang. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2010，53: 1250-1253.)并利用所建立的 方法研究了酶抑制剂动力学和抑制机理。从文献报道来看，目前，尚无采用CE技术进行脂 肪酶活性测定和抑制剂筛选的报道。 本课题拟在前期研究基础上，结合柱前反应技术，建立脂肪酶抑制剂的CE快速筛 选新方法。以脂肪酶为靶点，对中药粗提物进行筛选，研究活性分子对酶抑制作用的动力学 特性及抑制机理，推测两者的主要作用力类型，研究具有酶抑制活性的化合物的构效关系。 通过本课题的研究，建立脂肪酶抑制剂的CE筛选方法，为快速筛选发现海洋药物先导化合 物奠定坚实的理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种脂肪酶抑制剂的快速筛选方法。即利用柱前反应技术， 使该酶在水浴中催化水解底物，在紫外214nm处直接测定产物峰面积实现酶活的测定和酶 抑制剂的筛选。 本专利技术的又一目的是应用上述方法，快速、准确地确定抑制剂化合物的半数抑制 浓度即IC 5。值及抑制常数K ^直，从而为开发治疗肥胖症新药提供可能，为快速筛选发现海 洋药物先导化合物奠定坚实的理论基础。 本专利技术中所述的酶主要为猪胰腺脂肪酶（PPL)。 本专利技术中所述的PPL底物可以为某些酯类化合物，如4-甲基伞形酮油酸酯 (4-MU0)、2, 4-二硝基苯酚丁酸酯、4-硝基苯棕榈酸酯等。 本专利技术中所述的柱前反应技术属于均相酶反应测定方法，所用的仪器设备为毛细 管电泳仪，推荐采用安捷伦毛细管电泳仪。 所述的毛细管柱总长是20-100cm，柱内径为25-lOOMm，优选长度30-80cm，内径 25-75Wn〇 本专利技术的酶活测定和抑制剂筛选通过如下步骤来实现，1)将酶溶液和底物溶液 分别以10 - 80微升体积依次注入离心管中，所述的底物溶液可以含或不含待筛选化合物， 可测的酶的浓度范围为〇_5mg/mL，推荐酶的浓度范围为0. 5-2mg/mL，底物的浓度范围为 0-2mM;为了提高酶活性，底物溶液中可以含有无机钠离子和钙离子的盐，通常为氯化钠和 氯化钙，浓度分别为0-200mM; 2)使酶和底物于一定温度水浴中反应一段时间，一般为0-2 小时；3)从水浴中取出，加上一定电压，使酶、未反应底物及产物根据其电泳淌度的不同来 实现分离，通常电压为1千伏至30千伏。酶活用214nm处产物峰面积表示。待筛选化合物 可根据产物峰面积的变化来判定其是否具有抑制酶的活性。通常电泳分离采用pH为2-12 的缓冲液，最好采用pH为6-10缓冲液，其浓度为10-300mmol/L。所用的缓冲液可以为硼酸 盐、十二烷基硫酸钠及三(羟甲基）氨基甲烷、盐酸和三(羟甲基）氨基甲烷、盐酸、氯化钠、氯 化钙的缓冲液。 本专利技术可用于酶抑制作用的研究。通过在不同底物浓度、不同抑制剂浓度条件下 分别测定反应产物的量，得到相应的米氏曲线和Lineweaver-Burk曲线，从而测得脂肪酶 的米氏常数和抑制剂的抑制类型。以抑制剂不同浓度下测定的斜率对抑制剂浓度作图为一 条直线，从而求得抑制常数Ki。根据Prusoffs方程JCa^Kia+tSVKmKSz底物浓度，Km= 米氏常数)，计算IC 5。（半数抑制浓度)。 将本专利技术运用于中药粗提液中脂肪酶抑制剂的筛选。首先用已知的酶抑制剂对方 法的可行性进行验证，再将待筛选的中药粗提液加入底物溶液中通过计算其抑制作用百分 比来筛选酶抑制剂。而抑制作用百分比可以根据式（1)来计算得到： IRE%=100 (1-x/blank) (1) 方程式（1)中x为抑制剂存在时所测得的产物的量，blank为没有抑制剂时反应所生成 的产物的量。由于本专利技术具有毛细管电泳高的分离选择性的优点，因此在进行混合化合物 样品如中药粗提液的筛选时，可以有效地消除由于样品基质或各化合物组分对检测带来的 干扰。 本专利技术的积极效果及优点： 1)本专利技术操作简便，灵敏度高。 2)毛细管电泳的高分离选择性消除了由于复杂样品基质对于活性物质检测带来 的干扰，故特别适用于混合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脂肪酶抑制剂的筛选方法，其特征是采用柱前反应检测方法，在水浴中用酶催化水解底物，然后在紫外214nm处直接测定产物峰面积实现酶活的测定和酶抑制剂的筛选方法；所述的酶为脂肪酶；所述的底物为4‑甲基伞形酮油酸酯。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吕志华，姜廷福，种蕾，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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