本发明专利技术属于涉及一种基因工程领域，具体涉及一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法及其应用。采用靶向树突状细胞上C-型凝集素受体的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤干细胞抗原Sox2抗原，72小时快速成熟树突状细胞并且提高树突状细胞主动摄取抗原效率和MHC-I途径抗原呈递效率，比常规的7-8天收获成熟的DC能大大缩短肿瘤患者最佳治疗的时间窗口，有利于丰富成熟的树突状细胞刺激初始T细胞的信号诱导抗原特异性CTL产生；结合工程细胞和细胞因子大量扩增抗原特异性T细胞和Tcm，产生高比例的杀伤能力更强的Tcm，增强抗肿瘤免疫作用，是一种快速有效的肿瘤干细胞抗原特异性CTL的制备技术，有极大的经济价值和市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于涉及一种基因工程领域，具体涉及一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异 性CTL的制备方法及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤已成为人类第一号"杀手"，在人类抗癌历史上，与癌症抗争有过三大利 器：外科手术，化疗，与放射治疗。但这三种方法虽然能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍 不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移 的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型 的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。 至此，免疫科学家斯坦曼利用先前发现的树突状细胞（Dendritic cell，DC)，激 发自身的免疫力清除肿瘤，利用自己的研究成果，将生命由预期的数月延长到四年。由于 他对免疫领域的贡献在2011年获得诺贝尔生理医学奖，在肿瘤领域并开创了一个新的天 地一肿瘤免疫细胞治疗。他的研究成果现在已经广泛应用于临床，已经成为继手术、放、化 疗后的第四种癌症治疗方式。由于肿瘤免疫细胞治疗能够联合手术、化疗、放疗精准清除残 余肿瘤细胞，防止复发和转移，加强免疫监视作用，提升患者生存质量和时间，并且没有放 化疗的毒副作用和手术的巨大伤害。近年来，在临床应用中受到越来越广泛的关注，是国内 外研究的热点，已被公认为是最具前景的肿瘤治疗方法。 1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗 公司（Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。 但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大 量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。细胞毒性T淋巴细胞（CTL)构建是 近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热 点。 目前肿瘤的细胞免疫治疗效果仍不理想，主要原因包括如下两方面： 1)肿瘤患存在免疫抑制的微环境，一方面，肿瘤组织的T淋巴细胞产生免疫耐受， 另一方面，肿瘤细胞能够分泌多种免疫抑制因子，诱导产生调节性T淋巴细胞或抑制DCs功 能。 2)肿瘤免疫治疗中应用的抗原大多表达在已分化的肿瘤细胞上，而肿瘤干细胞并 不表达这些抗原，所诱发的免疫杀伤反应并不针对肿瘤干细胞。加上目前常规DC加入患者 肿瘤细胞裂解得到的肿瘤抗原，使DC负载肿瘤抗原，虽然这种方法能使得DC摄取到患者的 肿瘤抗原，但由于肿瘤抗原的抗原性较弱，DC对肿瘤抗原摄取量较少，其递呈抗原能力也就 较低，使其产生的CTL细胞的杀伤活性不足，并且利用单纯的细胞因子放大扩增CTL细胞数 量有限，产生的Tcm比例小，进而影响抗肿瘤治疗效果。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术中肿瘤免疫治疗抗原摄取量 少，产生的CTL细胞杀伤活性不足，抗肿瘤治疗效果不佳的局限性，从而提出一种杀伤能力 强，抗原性特异性强，缩短患者治疗时间且稳定性良好，便于操作和临床肿瘤过继性免疫细 胞治疗应用推广的HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法及其应用。 为解决上述技术问题，本专利技术的公开了一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL 的制备方法，所述方法为： 采用树突状细胞上的C-型凝集素类型的糖修饰的阳离子脂质体作为抗原载体， 包裹肿瘤干细胞抗原，制备抗原特异性T淋巴细胞。 所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述阳离子脂质体 包括磷脂酰乙醇胺双分子层、聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺以及甘露糖。 所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述的C-型凝集 素类型的糖为甘露糖或甘露糖苷。 所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述树突状细胞为 72小时快速成熟的负载肿瘤干细胞抗原Sox2的树突状细胞。 所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述抗原是 HLA-A0201限制性肿瘤干细胞抗原Sox2表位肽9肽，包涵表位肽15肽及包涵表位肽30肽 及人工合成和基因改造的或突变的Sox2抗原肽。 所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述的树突状细胞 包括外周血单核细胞诱导的树突状细胞，造血干细胞和脐血干细胞诱导的树突状细胞DC。 所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述阳离子脂质体 通过在磷脂分子的极性基团上连接甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。 所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述甘露糖在所述 聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺一端形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。 所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述的工程细胞跨 膜表达人4-1BBL、IL-21的K562细胞株的人工抗原提呈细胞。 任意所述一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法在生物工程领域 中的应用。 本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点： 本专利技术针对现有的肿瘤免疫细胞抗肿瘤疗效不佳等问题，提出采用72小时快速 成熟DC技术和靶向树突状细胞上C-型凝集素受体的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿 瘤干细胞抗原Sox2,通过大大提高DC细胞对肿瘤抗原的摄取效率和抗原呈递能力，增强其 抗肿瘤作用，结合工程细胞和细胞因子大量扩增抗原特异性T细胞和Tcm，从而增强抗肿瘤 免疫作用。 此外，本专利技术以肿瘤干细胞抗原Sox2制备的抗原特异性CTL创新之处在于：以肿 瘤干细胞为治疗的靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤干细胞的特异性细胞毒性T淋 巴细胞，直接针对肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有"治本"性。 本专利技术采用具有定向靶向的纳米脂质体负载肿瘤干细胞抗原制备抗原特异性T 淋巴细胞。与常规抗原特异性T淋巴细胞制备技术相比，本专利技术制备肿瘤干细胞抗原特异 性T淋巴细胞技术不仅采用新型纳米脂质体负载肿瘤干细胞抗原，以肿瘤干细胞为治疗的 靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤干细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞，直接针对 肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有"治本"性；而且采用72小时快速成熟树突状细 胞，比常规的7-8天收获成熟的DC能大大缩短肿瘤患者最佳治疗的时间窗口；同时采用工 程细胞放大扩增抗原特异性T淋巴细胞，能产生高比例的杀伤能力更强的Tcm。 本专利技术肿瘤干细胞抗原特异性T淋巴细胞制备方法简便易行，免疫靶点针对肿瘤 干细胞，抗原性强且稳定性良好，便于操作和临床肿瘤过继性免疫细胞治疗应用推广。【附图说明】 为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合 附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中： 图IA是本专利技术一个实施例2中72小时快速成熟树突状细胞表型； 图IB是本专利技术一个实施例2中72小时快速成熟树突状细胞表型； 图IC是本专利技术一个实施例2中72小时快速成熟树突状细胞表型； 图2A是本专利技术一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2 CTL细胞毒性因子IFN-r检 测； 图2B是本专利技术一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2 CTL细胞毒性因本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种HLA‑A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述方法为：采用树突状细胞上的C‑型凝集素类型的糖修饰的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤干细胞抗原，制备抗原特异性T淋巴细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈尚，刘根桃，李晓祥，
申请(专利权)人：深圳市中美康士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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