本发明专利技术公开了一种改进型恒温指数扩增技术及其在microRNA检测中的应用。本发明专利技术通过在常规指数扩增模板的5’端与引物互补的区域内的一碱基上修饰一生物素来调节引物与扩增模板3’端和5’端的杂交速度，建立了改进型恒温指数扩增方法。该方法较常规恒温指数扩增方法，具有扩增效率更高，速度更快的优点，而且标准曲线的线性范围更宽，特异性更好，灵敏度更高。本方法具有很好的精确性，重复性和稳定性，可发展成为试剂盒并向市场推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子检测领域，具体涉及一种改进型恒温指数扩增技术及其在 mi croRNA检测中的应用。
技术介绍
恒温指数扩增反应（Isothermal Exponential Amplification Reaction，EXPAR) 技术是由D. J. Galas等在2003年建立起来的一种基于DNA聚合酶和切口酶设计的高效核 酸扩增技术。该技术的原理如图1所示：应用一条中间包含切口酶识别序列，3'端与5'端 序列完全相同的模板，当引物与模板的3'端杂交后，在聚合酶的作用下进行线型扩增。扩 增后，内切酶识别并切割5'端扩增出来的片段，该片段在DNA聚合酶的链置换作用下被释 放出来，进一步与另一条模板的3'端进行杂交和扩增，形成指数形式的扩增。该方法可以 在恒温条件下对短链核酸（10-25碱基）进行高效、快速的指数扩增，一般在几分钟内可对 目标核酸放大1〇 6_1〇9倍。与PCR扩增技术相比，恒温指数扩增方法所需时间短，不需要精 确的热循环装置，其扩增倍数足以与PCR技术媲美。因此，恒温指数扩增反应技术已被广泛 应用于短核酸的检测，特别是对microRNA (miRNA)的定量分析。 MiRNA是一类对基因表达具有调控作用的非编码小分子RNA( 18-24碱基)。它在动 植物生长、发育、分化和生殖等过程中发挥着重要作用。人类约30%的基因受miRNA调控， 且miRNA的表达水平与人类重大疾病密切相关。对miRNA的定量检测有助于深入理解其作 用机制，对疾病的诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重要意义。由于miRNA的序 列短，在细胞或者体液内的表达水平非常低、易降解且同源miRNA之间仅相差1-2个碱基， 一般方法难以实现检测。Northern印迹技术是当前分析miRNA的标准方法，但该方法操作 繁琐、耗时长、灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，且对RNase污染非 常敏感，实验中任何一步操作不当都会影响分析结果。Microarray方法可实现高通量、多 组分miRNA同时检测，但该方法的特异性和灵敏度较低，并且微阵列芯片的制备和检测成 本很高。RT-PCR是灵敏检测miRNA的有效方法，但由于miRNA序列短，不适合直接使用PCR 扩增，需要依赖多种技术先将miRNA转录成cDNA再进行扩增，导致方法操作复杂，耗时长； 另外该方法需要精确的控温仪器，增加测定成本。恒温扩增检测miRNA的方法如滚环扩增 (RCA)、线性扩增、指数扩增(EXPAR)等由于能在恒温条件下获得高效的扩增，成为研究和应 用热点。
技术实现思路
由于现有的恒温指数扩增反应中的扩增模板的5'端和3'端的序列完全相同，弓丨 物在两端杂交的几率和速率也相同。杂交在3'端的引物能够正常扩增，而杂交在5'端的 引物无法扩增，因此，常规的恒温指数扩增反应损失了 50%的扩增效率。本专利技术通过对现有 指数扩增技术进行改进，抑制引物在扩增模板5'端的杂交，从而提高恒温指数扩增反应的 扩增效率，目标建立一种更为快速、高效和灵敏的恒温指数扩增技术并应用于短链核酸的 灵敏检测。 本专利技术所采取的技术方案是： 一种改进型恒温指数扩增模板，其包括3'端序列、5'端序列，以及3'端序列和5'端 序列之间的切口酶识别序列；所述3'端序列和5'端序列相同，均与待检核酸序列互补；5' 端序列至少有一个碱基上修饰有biotin。 进一步地，优选在5'端序列l-10bp的至少一个碱基上修饰biotin。 更进一步地，优选在5'端序列第2个碱基上修饰biotin。 -种用于检测miRNA let_7a的恒温指数扩增模板，其序列为： 5'-AACTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3'，其第 1-23 bp 至少有一个碱基修饰有biotin。 进一步地，优选在其序列的第1-10 bp的至少一个碱基上修饰biotin。 更进一步地，优选在5'端序列第2个碱基上修饰biotin。 -种改进型恒温指数扩增试剂盒，其包括： (1) 恒温指数扩增模板； (2) DNA聚合酶； (3) 内切酶； (4) 链酶亲和素。 进一步优选地，所述试剂盒中还包括：dNTP、SYBR Green I荧光染料、酶缓冲液。 一种改进型恒温指数扩增技术，包括如下步骤： (1) 将恒温指数扩增模板、dNTP、RNase抑制剂、待检样品和链酶亲和素混合制成A反应 液； (2) 将DNA聚合酶、内切酶、SYBR Green I荧光染料混合制成B反应液； (3) 将A反应液和B反应液混合后进行指数扩增反应； (4) PCR仪上监控扩增曲线，求得P0I值，根据建立的标准曲线求得目标核酸序列的浓 度。 指数扩增反应体系含有：0. 5XNt. BstNBI缓冲液、0. 1 y M恒温指数扩增模板、250 yMdNTP、0. 8 U/yL RNase抑制剂、待检样品、0. 2 yM链酶亲和素SA、lXThermoPol聚合酶 缓冲溶液、0.05 U/yL Vent(exo-)聚合酶、0.4 U/yL 切 口酶、0.4XSYBR Green I 荧光染 料、DEPC水；所述0? 5XNt. BstNBI 缓冲液含有：25 mMtris-HCl, pH 7. 90, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl, 0. 5 mM EDTA ;所述 lXThermoPol 聚合酶缓冲溶液含有：10mMKCl，10 mM (NH4)2S04, 20 mMTris-HCl pH 8.8,2 mM MgS04,0. 1% Triton X-100〇本专利技术的技术原理为： 根据待测miRNA序列设计扩增模板(如图2所示)。该模板包含三段序列：序列1和序 列3完全相同，且与目标miRNA序列互补；序列2为切口酶的识别序列；另外：在靠近模板 5'端的碱基上修饰一个生物素（biotin)，当溶液中加入链霉亲和素（SA)时，SA与biotin 结合可使扩增模板5'端的Tm值降低，在恒温指数扩增条件下，能提高目标miRNA序列与模 板3'端的结合效率，同时加速被切口酶剪切后的DNA片段从模板5'端离去的速度，从而提 高了指数扩增技术的扩增效率与灵敏度。其具体步骤如图3所示。 本专利技术的有益效果是： 本专利技术通过在常规指数扩增模板的5'端与引物互补的区域内的一碱基上修饰一生物 素来调节引物与扩增模板3'端和5'端的杂交速度，建立了改进型恒温指数扩增方法。该 方法较常规恒温指数扩增方法，具有以下优点： 1、 扩增效率更高，速度更快，缩短分析时间； 2、 标准曲线的线性范围更宽，特异性更好，灵敏度更高； 3、 方法具有很好的精确性，重复性和稳定性，可发展成为试剂盒并向市场推广。【附图说明】 图1为恒温指数扩增反应原理图。 图2为改进型恒温指数扩增方法模板设计示意图。 图3为改进型恒温指数扩增方法示意图。 图4为不同位点扩增曲线图。 图5为不同聚合酶量（A)和不同内切酶量（B)条件下let_7a扩增反应P0I值与 空白实验P0I值之差；（C) - (F)扩增反应在不同模板量条件下对let_7a和空白的扩增曲 线图。 图6为标准曲线图。 图7为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种改进型恒温指数扩增模板，其包括3’端序列、5’端序列，以及3’端序列和5’端序列之间的切口酶识别序列；所述3’端序列和5’端序列相同，均与待检核酸序列互补；5’端序列至少有一个碱基上修饰有biotin。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴宗，陈俊，邹小勇，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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