基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶制造技术

一种生物技术领域的基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶，通过将人工设计蜘蛛丝蛋白的羧基端结构域(CTD)及其衍生肽段的核苷酸序列，再将其无缝连接到pET‐19b质粒载体上，经由大肠杆菌表达后分离纯化，最后通过对应的温度控制形成水凝胶。本发明专利技术利用蜘蛛丝蛋白的CTD及其衍生肽段制备得到孔径致密且弹性模量高达105Pa的水凝胶，具体可用于组织工程等医学领域。

【技术实现步骤摘要】
基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶
本专利技术涉及的是一种可用于制备水凝胶的蛛丝蛋白材料，具体是将一种生物合成的蜘蛛牵引丝蛋白的羧基端结构域(CTD)及其衍生肽段制备成水凝胶。
技术介绍
水凝胶是由亲水性物质交联形成的三维空间网络结构。较高的含水量使其可以模拟天然生物生存的环境，并赋予其较好的生物相容性。另外，水凝胶多孔的微结构使其具有一定的可渗透性，而三维网状结构可以提供一定的机械支撑，所以水凝胶在医学，药学，生物材料方面有着广泛的用途，例如隐形眼镜，人造器官材料，及药物传输载体等。根据对外界环境刺激的响应情况，水凝胶可被分为传统型和智能型两大类。其中，智能型水凝胶是现今研究的热点，主要包括温敏型水凝胶、pH敏感型水凝胶、生物分子敏感型水凝胶、电场敏感型水凝胶等。目前，用于制备智能型水凝胶的分子大多是化学合成的多聚物，虽然这种多聚物的机械性能较好，但生物相容性较差，降解耗时太长，另外不利于细胞粘附。所以，科学家们把目光转向了生物聚合物，主要是一些天然存在的蛋白多肽类物质(如胶原蛋白，丝蛋白和明胶等)。这些多肽类物质具有很好的生物相容性和可降解性，且细胞毒性较低，被认为是制备水凝胶的理想材料。蜘蛛丝蛋白以其优越的机械性能(强度、弹性等)和生物相容性成为最近水凝胶研究的热点(SchachtK,ScheibelT.Biomacromolecules.2011,12(7):2488‐95.)。大部分的蜘蛛可以产七种丝，如牵引丝、小壶状腺丝、鞭毛状腺丝等。其中牵引丝作为蜘蛛网的主要骨架及逃生的生命线，因此具有其他纤维无法比拟的机械性能。牵引丝主要由牵引丝蛋白1和牵引丝蛋白2(MaSp1&2)组成(Gosline,J.M.；Guerette,P.A.；Ortlepp,C.S.；Savage,K.N.J.Exp.Biol.1999,202(Pt.23),3295‐3303.Hinman,M.B.；Jones,J.A.；Lewis,R.V.TrendsBiotechnol.2000,18,374‐379.)；前人的研究表明，MaSP1强度较高，而MaSP2弹性较好。牵引丝蛋白的结构具有一定的相似性，它们主要由重复片段结构域(Rep)和两端的氨基端结构域(NTD)、羧基端结构域(CTD)组成。其中Rep不断串联重复(大概100个)形成中间的部分，且被认为对纤维的机械性能比较重要；而两端的末端结构域(NTD和CTD)是非重复且较为保守的氨基酸序列，被认为对蛛丝蛋白的组装和排列做了重要贡献(SponnerA,SchlottB,VollrathF,UngerE,GrosseF,WeisshartK.2005a.Biochemistry44:4727‐4736.RisingA,HjalmG,EngstromW,JohanssonJ.2006.Biomacromolecules7:3120‐3124.GainesWA,MarcotteWR,Jr.2008.InsectMolBiol17:465‐474.)。其中关于CTD的研究还是较多的，结果表明其可促进蛛丝蛋白的溶解以利于高浓度蛋白溶液的储存；对pH、盐离子和剪切力(蜘蛛腺体中成丝过程的不断变化的物理化学因素)较为敏感，且可在剪切力作用下形成连接较好的纤维(Hagn,F.；Eisoldt,L.；Hardy,J.G.；Vendrely,C.；Coles,M.；Scheibel,T.；Kessler,H.Nature2010,465(7295),239-42.Askarieh,G.；Hedhammar,M.；Nordling,K.；Saenz,A.；Casals,C.；Rising,A.；Johansson,J.；Knight,S.D.Nature2010,465(7295),236-8.)。经过对现有技术的检索发现，PCT专利文献号WO2007/078239公开了一种分离富含Ala和Gly的重复片段和C端结构域的微型蜘蛛丝蛋白及可溶性蛋白的方法，并且提供了制备大壶腹腺蛛丝蛋白纤维的方法。PCT专利文献号WO2010/123450公开了一种构建并获得了既包含重复片段，又含有C端结构域和N端结构域的蜘蛛丝蛋白，并提供了一种分离以上所述的蛋白聚合物的方法。通过调节所用液体介质的pH、离子浓度等条件，获得了肉眼可见的纤维。中国专利文献号CN104045841A公开了一种通过将废蚕丝脱胶、溶解、透析处理后得到低浓度的丝素蛋白溶液，然后在常温下采用高速搅打匀质处理的方法得到凝胶化时间较短的丝素蛋白水凝胶。KristinSchacht等，Biomacromolecules.2011,12,2488‐2495.表达了园蛛科蜘蛛(Araneusdiadematus)的富含Ala和Gly的重复片段的蜘蛛丝蛋白，并通过提高浓度和化学交联的手段将其制备形成水凝胶。但该蛋白材料中不包含CTD。虽然关于CTD的研究日益深入，但到目前为止，还没有关于其能够形成水凝胶的报道。通过我们的研究，发现不同种属的蜘蛛丝蛋白的CTD及其衍生肽段对温度较为敏感，且可在高温和低温条件下形成水凝胶。作为蜘蛛丝蛋白的一部分，CTD形成的水凝胶既具有多肽类水凝胶的生物相容性、可降解性、细胞毒性低等优势，又具有蛛丝蛋白部分优越的机械性能，这将为水凝胶在组织工程，药物传输等医学工程中的应用提供更好的选择。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足提出一种基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶，通过利用公开的CTD及Rep的氨基酸序列设计和优化对应的核苷酸序列，在大肠杆菌中实现表达和生产，最终利用其温敏性制备形成水凝胶。利用蜘蛛丝蛋白的CTD及其衍生肽段制备得到孔径致密且弹性模量高达105Pa的水凝胶，具体可用于组织工程等医学领域。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术通过将人工设计的核苷酸序列无缝连接到pET‐19b质粒载体上，经由大肠杆菌表达后采集其中的蛋白溶液并稀释于磷酸盐缓冲液中，最后通过对应的温度控制形成水凝胶。所述的多肽为(Rep)x‐(CTDn)y，其中：整数x代表Rep，即络新妇属蜘蛛(Nephilaclavipes)牵引丝蛋白1(MaSP1)中单体序列重复的次数，取值范围为[0,16]；整数y代表CTD，即络新妇属蜘蛛(Nephilaclavipes)、园蛛科蜘蛛(Araneusdiadematus)或非洲育儿网蛛(Euprosthenopsaustralis)的MaSP1的羧基末端结构域(CTD)序列重复的次数，取值范围为[1,8]；整数n代表CTD的种类，当n取1、2、3时，分别代表NcCTD、AdCTD、EaCTD。所述的多肽中，x、y和n在相应区间内自由组合，如x取4、y取1、n取1时，即(Rep)4‐CTD1,其中：CTD1即为NcCTD。所述的Nephilaclavipes牵引丝蛋白1(MaSP1)重复序列的单体氨基酸序列，如SeqIDNo.1所示，即：N’‐GRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG‐C’，来自于文献XuMingandRandolphV.Lewis*.Structureofaproteinsuperfiber:Spiderdraglinesilk.Proc.Nat本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，通过将人工设计的核苷酸序列无缝连接到pET‐19b质粒载体上，经由大肠杆菌表达后采集其中的蛋白溶液并稀释于磷酸盐缓冲液中，最后通过对应的温度控制形成水凝胶；所述的多肽为(Rep)x‐(CTDn)y，其中：整数x代表Rep，即络新妇属蜘蛛(Nephila clavipes)牵引丝蛋白1(MaSP1)中单体序列重复的次数，取值范围为[0,16]；整数y代表CTD，即络新妇属蜘蛛(Nephila clavipes)、园蛛科蜘蛛(Araneus diadematus)或非洲育儿网蛛(Euprosthenops australis)的MaSP1的羧基末端结构域(CTD)序列重复的次数，取值范围为[1,8]；整数n代表CTD的种类，当n取1、2、3时，分别代表NcCTD、AdCTD、EaCTD。

【技术特征摘要】
1.一种基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，通过将人工设计的核苷酸序列无缝连接到pET-19b质粒载体上，经由大肠杆菌表达后采集其中的蛋白溶液并稀释于磷酸盐缓冲液中，最后通过对应的温度控制形成水凝胶；所述的蛋白溶液中的多肽为(Rep)x-(CTDn)y，其中：整数x代表Rep，即络新妇属蜘蛛(Nephilaclavipes)牵引丝蛋白1(MaSP1)中单体序列重复的次数，取值范围为[0,16]；整数y代表CTD，即络新妇属蜘蛛(Nephilaclavipes)、园蛛科蜘蛛(Araneusdiadematus)或非洲育儿网蛛(Euprosthenopsaustralis)的MaSP1的羧基末端结构域(CTD)序列重复的次数，取值范围为[1,8]；整数n代表CTD的种类，n为1、2、3，分别代表NcCTD、AdCTD、EaCTD；所述的Nephilaclavipes牵引丝蛋白1(MaSP1)重复序列的单体氨基酸序列，如SeqIDNo.1所示；所述的NcCTD的氨基酸序列如SeqIDNo.3所示；所述的AdCTD的氨基酸序列如SeqIDNo.4所示；所述的EaCTD的氨基酸序列如SeqIDNo.5所示；所述的人工设计核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏小霞，秦看看，钱志刚，周名亮，宋雯雯，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31