本发明专利技术公开了表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）在制备抗呼吸道合胞病毒（RSV）药物中的应用，属于抗病毒药物领域。本发明专利技术发现EGCG在体外和体内均能抑制RSV感染，且无毒副作用。EGCG在体外能保护细胞免受RSV的感染且能抑制RSV在细胞内的生物合成；在体内能减轻RSV感染所致肺组织病理损害，并降低肺组织中RSV病毒滴度。上述发现表明EGCG可用于制备抗RSV的药物，也可用于制备治疗和/或预防RSV引起的肺部疾病的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗病毒药物领域，具体涉及表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG)在制 备抗呼吸道合胞病毒（RSV)中的应用。
技术介绍
呼吸道合胞病毒（Respiratorysyncytialvirus，RSV)属副黏病毒科肺炎病毒 属，是一种有包膜的单股负链RNA病毒，有1个血清型，可分为A、B两个亚型。呼吸道合胞病 毒严重危害着婴幼儿健康，是住院儿童患者较常见的呼吸道感染性病原体，每年约40%~ 50%住院治疗的婴幼儿毛细支气管炎和25%的婴幼儿肺炎是RSV感染所致。呼吸道合胞病 毒首次感染多为年龄小于1岁的婴儿，主要侵犯毛细支气管、支气管和肺泡，导致呼吸道合 胞病毒肺炎，临床表现为以发热、咳嗽、喘憋为主要症状，严重者可出现呼吸困难，是儿童支 气管哮喘发生的重要危险因素。呼吸道合胞病毒也可感染成年人，是引起约50%的成年人 支气管哮喘加重的一种病原体，65岁以上的老年人下呼吸道感染和循环系统疾病死亡中， 有78%多与RSV相关。目前临床应用利巴韦林、干扰素治疗呼吸道合胞病毒感染，可减轻症 状、缩短病程和排毒时间，但均存在疗效不够理想，有明显的毒副作用等，且至今仍未有安 全有效的预防疫苗。因此，研究和开发一种高效、安全、副作用少的抗呼吸道合胞病毒感染 的新药具有重大意义。 茶多酚是从茶叶中提取的一类组成复杂、相对分子质量不同、性质与结构差异很 大的多羟基酚类混合物。其中以儿茶素为主的黄烷醇类化合物是茶多酚的主体部分，占茶 多酚总量的60%~80%，包括表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG)、表没食子儿茶素（EGC)、 表儿茶素没食子酸酯（ECG)、表儿茶素（EC)，尤其是EGCG最引人注目，在茶叶生物化学中研 究最广泛、最深入。EGCG是茶叶特有的儿茶素，含量最高，占茶多酚制品的40%~50%，它 是2-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯，同时因其结构中有6个邻位酚羟基而具有优 于其他儿茶素的许多性质。现代科学研究表明EGCG具有显著的抗突变、抗氧化作用，能增 强机体免疫力、抑制肿瘤生长、抑制肝脂和胆固醇的增长，对痢疾、伤寒、金黄色葡萄球菌也 有很强的抑制作用。国外有文献报道EGCG体外可通过抑制HIV-I逆转录酶的活性发挥抗 HIV的作用，另外还可通过抑制细胞内内涵体或溶酶体的酸化影响流感病毒的感染性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供EGCG在制备抗呼吸道合胞病毒药物以及EGCG在制备治疗 和/或预防呼吸道合胞病毒引起的肺部疾病的药物中的应用。 为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施： UEGCG对RSV感染靶细胞一HEp-2细胞的毒性：HEp-2细胞加入不同浓度（2yg/ mL, 4yg/mL，8yg/mL，16yg/mL，32yg/mL，64yg/mL和 128yg/mL)的EGCG，培养 48h，通 过MTT法检测EGCG的细胞毒性作用，选择无毒或弱毒浓度的EGCG进行随后的抗RSV作用 研究。 2、EGCG抗RSV活性的测定： (I)EGCG在HEp-2细胞中抗RSV感染的作用效果： 1)取不同浓度的EGCG加入HEp-2细胞中，37°C孵育2h，弃上清，PBS洗3次，再加 入RSV病毒吸附lh，弃上清，PBS洗3次，再加入细胞维持液35°C培养，观察细胞病变（CPE)， 待到病毒对照孔CPE呈+++~++++(彡75%的细胞出现CPE)且细胞对照正常时，用MTT法 检测病毒抑制率，来判定EGCG对病毒侵入细胞是否具有阻断作用。 2)取不同浓度EGCG各100yL分别与20yLRSV病毒液混合，于35°C作用lh，随 后将药物和病毒的混合液加入ffip-2细胞中，35°C吸附lh，弃上清，用PBS洗3次，最后加 细胞维持液35°C培养，观察CPE，待到病毒对照孔CPE呈+++~++++且细胞对照正常时，用 MTT法检测病毒抑制率，来判定EGCG能否直接灭活RSV。 3)先用RSV感染HEp-2细胞，35°C吸附Ih后，弃病毒液，于培养孔中加入含不同浓 度EGCG的培养液，35°C培养，观察CPE，待到病毒对照孔CPE呈+++~++++且细胞对照正常 时，用MTT法检测病毒抑制率，以此判定EGCG在RSV穿入细胞后对其是否具有抑制作用。 数据统计：用SPSS17. 0软件进行统计学分析。上述各项实验均重复3次，然后分 别计算各组数据均数（i)及标准差（s)。将MTT法所测值计算出的细胞存活率和病毒抑制 率，采用Probit回归法计算出病毒半数组织感染量（TCIDm)、药物半数毒性浓度（TC5。）和 药物半数有效浓度（IC5。)，药物治疗指数（TI) =TC5(]/IC5。。 (2)EGCG在体内抗RSV感染的作用效果： I)EGCG对RSV在BALB/c小鼠中复制的影响：RSV感染后2h给药，连续灌胃给药7 天，EGCG处理后可明显抑制小鼠肺组织中的病毒复制，且随着给药剂量的增加，感染小鼠肺 组织中病毒滴度逐渐降低。 2)EGCG对RSV引起的肺部炎症的影响：RSV感染后2h给药，连续灌胃给药7天， EGCG处理后可显著减轻RSV感染小鼠的肺组织病理改变。 通过上述研究，本专利技术发现EGCG在体外和体内均能抑制RSV感染，且无毒副作用。 EGCG在体外能保护细胞免受RSV的感染和抑制RSV在细胞内的复制；在体内能抑制RSV在 小鼠体内的复制并减轻病毒感染所致的组织病理损害，降低病毒滴度。基于此，EGCG可用 于制备抗RSV的药物，同时也可用于制备治疗和/或预防RSV引起的肺部疾病的药物。 本专利技术与现有临床上用于治疗RSV感染的药物相比，具有以下优点和效果： 1、EGCG抗RSV病毒作用具有多种途径，既可保护细胞不受病毒感染，也可抑制病 毒在细胞中的复制。 2、在体内EGCG可明显减轻RSV感染所致的肺部病理损害，且无明显的毒副作用。【附图说明】 图1是表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG)的结构式。 图2是不同处理组BALB/c小鼠肺组织的HE染色病理切片图。 图3是用实时荧光定量PCR检测不同处理组BALB/c小鼠肺组织中RSV核酸水平 的结果图，*表示P〈〇. 〇5vs安慰剂对照组（Pla)、**表示P〈0.Olvs安慰剂对照组（Pla)。 图4是采用空斑实验检测小鼠肺组织匀浆中RSV病毒滴度的结果图，**表示 P〈0.Olvs安慰剂对照组（Pla)、#*表示P〈0.OOlvs安慰剂对照组（Pla)。【具体实施方式】 以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指 明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。EGCG是2-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯，分子式为C22H18O11,分子量为 458. 4,结构式如图1所示。EGCG已商品化，下述实施例中所用EGCG购于Sigma公司，其纯 度彡98%。 实施例1-4中各项实验均重复3次，然后分别计算各组数据均数（5)及标准差 (s) 〇 实施例IMTT法检测EGCG的细胞毒性作用DMEM(含10%胎牛血清，V/V)培养的HEp-2细胞用胰酶消化后稀释成1~3XIO5 个/mL，每孔IOOyL接种于96孔板。细胞长成单层后，加入IOOyL用DMEM(含2%胎牛 血清，V/V本文档来自技高网...
【技术保护点】
表没食子儿茶素没食子酸酯在制备抗呼吸道合胞病毒药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯炜，王晓昆，罗凡，曲川，张文斐，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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