一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法技术

一种针对膨胀污泥中H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法，涉及污水生物处理领域。H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式(PCR)方法反应体系：2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl；DNA模板0.5-1μl；正向引物；反向引物；加灭菌水到总体积20μl。反应程序：①1个循环：温度为94℃时间为2-5min。②30个循环：依次为变性温度94℃，时间20-30s；复性温度50-55℃，时间30s-1min；延伸温度72℃，时间2min。③1个循环：温度72℃，时间5-10min。PCR反应后将扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中跑胶，得到分离良好的DNA亮条带。本发明专利技术可以高效PCR反应扩增，对H.hydrossis丝状菌群进行鉴定分析，为后续该菌种相关菌群发育树分析及菌群绝对定量分析提供基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及污水生物处理领域，提供一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis (H. hydrossis)丝状菌群的聚合酶链式反应方法，可以高效地对H. hydrossis丝 状菌群进行PCR反应扩增，对污泥中H. hydrossis丝状菌菌种进行鉴定分析，为后续菌群定 量分析提供技术支持。
技术介绍
活性污泥膨胀，根据诱因可分为：因丝状菌异常增殖所导致的丝状菌性膨胀和因 粘性物质大量产生积累的非丝状菌膨胀。前者为易发与多发性膨胀，导致产生丝状菌性污 泥膨胀的细菌主要有：球衣菌属，假单胞菌属，黄杆菌属，酶菌属。H. hydrossis丝状菌群是 引起各污水处理工艺污泥膨胀常见菌种之一，因此考察活性污泥中H. hydrossis丝状菌群 及与其相互作用菌种的群落结构特性以抑制其过度生长具有重要意义。 然而，目前国内外由于分析技术的限制，对于各种丝状菌的鉴定与分析方法也不 尽相同。①传统的丝状菌鉴定方法是根据丝状菌的形态特征和染色反应来确定丝状菌种 属。尽管这种方法很有用，但是存在一定的限制性。例如1701，0092, 0961等类型丝状菌的 形态随条件的变化而变化，且此方法对操作人员要求较高，需专门培训，否则容易出现判断 错误的情况。②分子生物法鉴定污泥丝状菌。目前应用最为有效和广泛的是荧光原位杂交 (FISH)方法，它采用特殊荧光素标记核酸（DNA)探针，可在染色体、细胞和组织切片标本上 进行DNA杂交，可以检测细胞DNA或RNA的特定序列存在与否。然而此方法无法进行后续 菌群的准确定量及相关菌群发育树分析。 因此，目前缺乏针对H. hydrossis丝状菌群的PCR试验方法，对其中的 H. hydrossis丝状菌群进行PCR扩增分析，对相关菌群发育树进行分析以及后续进行该菌 群的定量分析。
技术实现思路
针对上述研究的不足之处，本专利技术提供针对H. hydrossis丝状菌群聚合酶链式反 应方法，可以高效地进行H. hydrossis丝状菌群PCR反应扩增，对污泥中H. hydrossis丝状 菌菌群进行鉴定分析，分析相关菌群发育树，同时为后续该菌群定量分析研究提供基础。 针对膨胀污泥中H. hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应（PCR)方法，特征在于： (1)H. hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法的反应体系： 2倍浓度的Taq PreMix试剂10 y 1 ;DNA模板0? 5-1 y 1 ;正向引物（序 列为 5' -AGGATGAACGCTAGCGGG-3'，浓度为 10 y m/L)0. 5-1 y 1 ;反向引物（序列为 5' -CTTAGCCCCAGTTACTGGmT-3'，浓度为 10 y m/L)0. 5-1 y 1 ;加灭菌水到总体积 20 y 1。 (2)H. hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应的反应程序： ①1个循环：温度为94°C时间为2-5min。 ②30个循环：依次为变性温度94°C，时间20-30S ;复性温度50-55 °C，时间 30s_lmin ;延伸温度 72°C，时间 2min。 ③1个循环：温度72°C，时间5-10min。 (3)后续进行H. hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应（PCR)反应，并将扩增产物在 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳中跑胶，得到分离良好的DNA亮条带。 进一步，本专利技术膨胀污泥中H. hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应（PCR)方法： (1)准备200 y 1离心管，依次加入2倍浓度的Taq PreMix试剂10 y 1 ;D NA模板 0. 5-1 y 1 ;正向和反向引物（10 ym/L)各0. 5-1 y 1 ;加灭菌水到总体积20 y 1 ;同时用灭菌 水代替DNA模板进行阴性对照试验。 (2)将装有阴性对照及样品的200 y 1 PCR反应离心管做好标记，放入TE CHNE TC-512 型 PCR 仪。 (3)设定反应程序：①1个循环：温度为94°C时间为2-5min。②30个循环：依次为 变性温度94°C，时间20-30s;复性温度50-55°C，时间30s-lmin;延伸温度72°C，时间2min。 ③1个循环：温度72°C，时间5-10min进行试验。 与现有技术相比，本专利技术具有以下优点： (1)本专利技术提供的H. hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应（PCR)方法的反应体系 和反应程序可以高效地进行H. hydrossis丝状菌群PCR试验，可以得到分离效果良好的目 的条带，对该菌群进行定性分析。 (2)本专利技术提供的H. hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应（PCR)方法后续可以进 行H. hydrossis丝状菌菌群发育树研究。 (3)本专利技术提供的H. hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应（PCR)方法为后 H. hydrossis丝状菌菌群定量分析打下了基础。【附图说明】 图1为本专利技术H. hydrossis丝状菌群革兰氏染色图片（1000倍） 图2为本专利技术H. hydrossis丝状菌群PCR产物1. 5%琼脂糖凝胶电泳图 图3为本专利技术H. hydrossis丝状菌群凝胶回收产物1. 5%琼脂糖凝胶电泳图【具体实施方式】 下面结合附图和具体实施方法对本专利技术作进一步详细说明，本专利技术H. hy drossis 丝状菌群聚合酶链式反应（PCR)包括以下步骤： (1)将膨胀污泥进行革兰氏和纳氏染色，分析其中有无疑似H. hydrossis丝状菌 群（见图1)。 (2) DNA提取试剂盒提取污泥中DNA。 (3)准备200 y 1离心管，依次加入2倍浓度的Taq PreMix试剂10 y 1 ;DNA模板 lyl ;正向引物和反向引物（l〇ym/L)各0. 6yl ;加灭菌水到总体积20yl ;同时用灭菌水 代替DNA模板进行阴性对照试验。(4)将装有阴性对照及样品的200 y 1 PCR反应离心管做好标记，放入TE CHNE TC-512 型 PCR 仪。 (5)设定反应程序：①1个循环：温度为94°C时间为2min。②30个循环：依次为 变性温度94°C，时间30s ;复性温度51°C，时间40s ;延伸温度72° C，时间2min。③1个循 环：温度72°C，时间lOmin。 (6)将PCR扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳试验，观察目的DNA条带的分离效 果良好（图2)，进行下一步。 (7)将目的条带进行割胶，用DNA回收试剂盒进行目的DNA纯化，将纯化产物跑胶 看纯化分离效果，得到单一的亮条带（图3)，进行下一步。 (8)将目的DNA与载体连接后转化到感受态细胞。 (9)将转化后的感受态细胞涂板，37°C恒温箱过夜培养。 (10)挑菌摇菌将菌液送测序公司测序，将测序序列与目的菌种的DNA序列对比分 析，发现与目的菌群序列一致。 以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。【主权项】1. 一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群的引物，其核苷酸序 列为： 正向：5' -A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群的引物，其核苷酸序列为：正向：5’‑AGGATGAACGCTAGCGGG‑3’反向：5’‑CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT‑3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高春娣，田烨，焦二龙，王惟肖，樊士信，李任飞，彭永臻，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11