一种用于检测副流感病毒的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测副流感病毒的试剂盒及其应用。本发明专利技术所提供的试剂盒中含有用于检测副流感病毒的引物对组，由3个引物对组成，其序列为序列表中序列1-6。本发明专利技术提供的试剂盒支持高通量，可快速、准确地检测副流感病毒感染，对于临床而言，能够在1小时内获得3种病毒指标的检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。同时，多指标的检测也可以用于地域性的流行病学调研和疫情监控，以研究副流感病毒感染在中国的流行情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸扩增
，涉及一种用于检测副流感病毒的试剂盒及其应用。
技术介绍
人类副流感病毒(HPIVs)是经常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)。与RSV一样，人类副流感病毒可以造成反复发作的上呼吸道感染(如感冒和喉咙痛)。它也能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病(如肺炎，支气管炎和细支气管炎)，特别是在老年人和免疫缺陷人群中。从血清学上人类副流感病毒可分为4型(I型到IV型)。四种亚型各有不同的临床和流行病学特征。I型和II型最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，I型是这种儿童喉气管支气管炎的主要原因，II型次之。I型和II型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾病。III型经常导致肺炎和细支气管炎。IV型很难检出，可能是因为它很少导致严重的疾病。人类副流感病毒的潜伏期一般在1～7天左右。早期快速诊断副流感病毒感染能够及时指导临床治疗为合理选择抗病毒抗细菌药物提供依据并在防止抗生素滥用方面具有重要意义。目前检测副流感病毒的方法较多，但都存在不足，如电镜检测方法复杂昂贵，病毒分离培养耗时极长且假阴性较多，在拿到培养结果后通常已失去临床意义，酶联免疫法检测的是病毒特异性抗体但一次仅能检测一种病毒。而基于核酸扩增的核酸检测，由于速度快(通常3小时内可完成检测)、灵敏度高、特异性好，在病毒检测领域正逐渐成为金标准。依赖核酸序列的扩增技术(NucleicAcidSequenceBasedAmplification)，即NASBA扩增技术，是由一对引物介导的、在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩增的过程。在41℃恒温条件下，在反应速度方面，NASBA扩增1h可将模板RNA扩增约109～1012倍，而通常的PCR反应需要2～3h。在检测灵敏度方面，NASBA可以检测到溶液中低于10genecopies/μl的痕量靶标，而PCR的检测限在100genecopies/μl左右。因此，NASBA技术无论是扩增效率还是检测灵敏度都高于RT-PCR技术。而又由于NASBA的反应仅需要一个41℃的恒温条件，水浴锅即可满足反应要求，不需要复杂的升降温等常规PCR所依赖的温控设备，因此NASBA技术的仪器成本非常低廉。与相应的检测技术结合，NASBA还具有操作简便、特异性强等诸多优点。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测副流感病毒的引物对组。本专利技术所提供的用于检测副流感病毒的引物对组，由如下3个引物对组成：由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1；由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2；由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对3。其中，所述引物对1(PIV1)用于扩增副流感病毒I型；所述引物对2(PIV2)用于扩增副流感病毒II型；所述引物对3(PIV3)用于扩增副流感病毒III型。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测副流感病毒的成套单链DNA。本专利技术所提供的用于检测副流感病毒的成套单链DNA，由探针组和所述引物对组组成；所述探针组由如下3个单链DNA探针组成：序列表中序列7所示的单链DNA探针1；序列表中序列8所示的单链DNA探针2；序列表中序列9所示的单链DNA探针3。其中，所述单链DNA探针1(PIV1_TY_MB)用于实时监测所述引物对1的扩增结果；所述单链DNA探针2(PIV2_TY_MB)用于实时监测所述引物对2的扩增结果；所述单链DNA探针3(PIV3_TY_MB)用于实时监测所述引物对3的扩增结果。所述探针组中的每条单链DNA探针的5’端均标记有荧光报告基团FAM，3’端均标记有荧光淬灭基团TAMRA。在本专利技术所提供的所述成套单链DNA中，每个引物对及其对应的单链DNA探针可单独包装在一个包装内。如所述引物对1和所述单链DNA探针1包装在第一个包装内；所述引物对2和所述单链DNA探针2包装在第二个包装内；所述引物对3和所述单链DNA探针3包装在第三个包装内。本专利技术的第三个目的是提供一种用于检测副流感病毒的试剂盒。本专利技术所提供的用于检测副流感病毒的试剂盒，含有所述引物对组或所述成套单链DNA。所述试剂盒还可含有内对照引物对和内对照探针。所述内对照引物对为用于扩增人基因组中管家基因GAPDHmRNA的引物对GAPD_IC，由序列表中序列10和序列11所示的两条单链DNA分子组成。所述内对照探针(GAPD_IC_MB)为序列表中序列12所示的单链DNA探针，用于实时监测所述内对照引物对(GAPD_IC)的扩增结果。所述内对照探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。所述试剂盒中还可含有恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液。所述恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mMpH8.0的Tris-HCL，50mMDTT，10mMdNTP，10mMrNTP，80mMMgCl2，450mMKCl，15％体积百分含量DMSO，1M山梨醇，20mM四甲基氯化铵。所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/μl，T7RNA聚合酶5U/μl，核糖核酸酶H0.5U/μl，焦磷酸酶0.5U/μl，RNA酶抑制剂5U/μl，BSA0.5μg/μl。所述试剂盒中还可含有碟式芯片，如24反应腔碟式芯片。在本专利技术中，所述24反应腔碟式芯片为博奥生物集团有限公司生产的“晶芯RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪”的配套碟式芯片，其型号为1×24。所述碟式芯片的1#至5#反应腔分别存放干燥的如下(1)-(5)：(1)所述引物对1和所述单链DNA探针1；(2)所述引物对2和所述单链DNA探针2；(3)所述引物对3和所述单链DNA探针3；(4)所述内对照引物对和所述内对照探针；(5)阴性对照品。所述阴性对照品具体可为无RNA酶的水(Rnase-free水)。其中，将引物和探针包埋入碟式芯片的方法为：将引物、与所述引物相对应的探针、琼脂糖混合，配制成混合溶液，使所述引物、所述探针和所述琼脂糖在所述混合溶液中的终浓度分别为0.2μM、50nM、0.1％(质量百分含量)；取1μl所述混合溶液点入相应的碟式芯片反应腔，于洁净超净台内晾干后，压片封装，冲压抽真空后制成。所述引物对组或成套单链DNA或试剂盒在检测或辅助检测副流感病毒中的非诊断目的应用也属于本专利技术的保护范围。在所述应用中，将15μl所述恒本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测副流感病毒的引物对组，由如下3个引物对组成：由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1；由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2；由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对3。

【技术特征摘要】
1.用于检测副流感病毒的引物对组，由如下3个引物对组成：
由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1；
由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2；
由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对3。
2.用于检测副流感病毒的成套单链DNA，由探针组和权利要求1所述的引物对
组组成；
所述探针组由如下3个单链DNA探针组成：序列表中序列7所示的单链DNA探
针1；序列表中序列8所示的单链DNA探针2；序列表中序列9所示的单链DNA探
针3。
3.根据权利要求2所述的成套单链DNA，其特征在于：所述探针组中的每条单
链DNA探针的5’端均标记有荧光报告基团FAM，3’端均标记有荧光淬灭基团
TAMRA。
4.用于检测副流感病毒的试剂盒，含有权利要求1所述的引物对组或权利要求2
或3所述的成套单链DNA。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有内对照引物
对和内对照探针；所述内对照引物对由序列表中序列10和序列11所示的两条单链
DNA分子组成；所述内对照探针为序列表中序列12所示的单链DNA探针；
具体的，所述内对照探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭
基团TAMRA。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有恒温
扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液；
所述恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mMpH8.0的Tris-HCL，
50mMD...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，盖伟，邢婉丽，马桂红，程京，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11