本发明专利技术涉及由鞭毛蛋白与热休克蛋白gp96制备的融合蛋白Flagp96疫苗佐剂。本发明专利技术的疫苗佐剂具有如下的特性：①Flagp96能与Toll-like受体结，活化抗原提呈细胞；②启动特异性CD8+和CD4+T细胞免疫应答；③具有分子伴侣功能，能与细胞内大量多肽非共价结合，包括细胞中的肿瘤抗原、病毒抗原或胞内细菌抗原。另外，本申请还涉及编码融合蛋白Flagp96的核酸以及融合蛋白Flagp96的制备方法。此外，本发明专利技术还提供疫苗组合物，其包括上述佐剂，还包括细胞中的肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疫苗佐剂，尤其涉及由鞭毛蛋白与热休克蛋白gp96制备的融合 蛋白Flagp96疫苗佐剂。另外，本申请还涉及编码融合蛋白Flagp96的核酸以及含有该融 合蛋白Flagp96的疫苗组合物。
技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁人类的健康的多发病和常见病。手术、化疗和放疗是治疗恶 性肿瘤的三大传统疗法。肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，提高肿瘤的免疫原性，制备高效 的肿瘤疫苗已成为免疫治疗的热点。最有效的疫苗必须既能激活CD4 +T细胞又能激活CD8+T 细胞，因此基于树突状细胞的免疫治疗和肿瘤疫苗具有极大的开发及临床应用价值。 树突状细胞（dendritic cells，DCs)是体内功能最强的专职抗原提呈细胞 (antigen presenting cell，APC)，可以通过HLA限制的方式向处女T细胞呈递抗原，能够 高水平表达MHC-I、MHC-II类分子，可以分泌免疫刺激因子，表达黏附和共刺激分子，从而 诱发CD4 +Th细胞的有效初始化和产生强效的抗肿瘤CTLs，制备DC疫苗的策略旨在诱导抗 原特异性免疫应答和形成免疫记忆。目前，将自体/异体肿瘤细胞或肿瘤抗原与树突状细 胞融合，虽可增强其免疫原性，提高CDS +T细胞的杀瘤活性，但杀伤效应有限，操作复杂，成 本高昂，且肿瘤特异性抗原筛选困难，难于大规模临床应用。而佐剂是一种非特异性的免疫增强剂，将体液免疫转变为细胞免疫，改变免疫球 蛋白的种类和亚类，消除免疫耐受性从而增强免疫反应。理想的佐剂应该有以下特征：能促 进体液和细胞介导的免疫，也能作用于弱免疫性抗原，而且不引起有害的副作用，能以不同 途径免疫，也能用于不同抗原，能在免疫抑制个体中发挥作用，应用于食用动物不应留有毒 素残留，能有效影响免疫反应质量，并且性能稳定、便宜而且容易产生。 树突状细胞作为体内功能最强的专职抗原提呈细胞，是连接抗原与免疫应答细胞 以激发有效抗肿瘤免疫应答反应的桥梁。基于活化树突状细胞的肿瘤疫苗，通常以自身肿 瘤细胞和同种异体DC融合，产生的融合细胞表达肿瘤抗原并具DC的共刺激能力；或以肿瘤 相关抗原、肿瘤细胞溶解物负载DC疫苗，可在不同癌症的治疗中产生肿瘤特异性CD8 +T细 胞免疫应答。但其临床应用中发现许多肿瘤缺乏明确的特异性抗原肽，且单一抗原肽负载 DC增加了诱导多样化肿瘤免疫耐受的危险性，这使得肿瘤成分负载DC的免疫治疗缺乏有 效靶点。 鞭毛蛋白，是构成细菌的鞭毛纤维的粒状蛋白质，具有较强的抗原性，可以通过自 身激发先天性免疫系统产生应答，发挥较强的免疫佐剂作用。我们已经确定Toll-Iike受 体（TLR)功能特性，先天性免疫系统精确熟练的检测入侵的病原微生物。通过TLR识别微 生物组分启动信号转导途径，从而触发基因的表达。这些基因产物控制先天免疫反应和进 一步指导抗原特异性获得性免疫的发展。 TLR5是鞭毛蛋白受体的一部分，主要表达于肺和肠上皮细胞、单核/巨噬细胞，小 肠的固有层未成熟树突状细胞，是鞭毛蛋白的受体。在体内，鞭毛蛋白能够增强抗原特异性 CD4+T细胞扩增和记忆的发展，与TLR-5相互作用，诱导产生了促炎症反应和激活宿主的树 突状细胞。此外，鞭毛蛋白能诱导大量促炎性介质，如TNF-a、IL-l、IL-6、MIP_3a和iNOS， 可参与细菌相关病理的发展。类似于内毒素，鞭毛蛋白是全身性炎症反应的有效介质。 热休克蛋白（HSP) gp96是一种高度保守和呈单态性的蛋白质。gp96可与DC表面 的受体（如CD91、CD40、Toll-Iike受体和清道夫受体等）相互作用，通过CD14PTLR2和 CD14PTLR4介导的信号转导途径诱导DC成熟并增强其功能，促进CD8 +和CD4 +T细胞细胞增 殖和分泌细胞因子。能与细胞内大量多肽非共价结合而不受细胞单倍型和MHC分子的影 响，包括细胞中的肿瘤抗原、病毒抗原或胞内细菌抗原。gp96-肽复合物也可在体外形成，并 具有与体内相似的免疫活性。gp96-肽复合物通过gp96的特异性受体CD91介导的内吞被 抗原提呈细胞摄取，然后通过内源性途径将其结合的抗原肽提呈给MHC I类和II类分子， 从而启动特异性T细胞CD8+和CD4 +T细胞免疫应答。 综上所述，开发简便、高效、多功能的免疫佐剂迫在眉睫，然而，现有技术中没有将 鞭毛蛋白与热休克蛋白融合gp96从而作为免疫佐剂的研究。
技术实现思路
本专利技术的申请人通过深入研究发现，通过使鞭毛蛋白与热休克蛋白gp96融合得 到的融合蛋白Flagp96能够使鞭毛蛋白和热休克蛋白gp96能够使两者的功能产生协同效 应，达到增强特异抗原性，同时能有效活化抗原递呈细胞并增强其抗原递呈能力，刺激特化 树突状细胞、CD8+T淋巴细胞和自然杀伤（NK)细胞等，功能性激活所必需的其他免疫信号。 从而极大地增强机体天然免疫反应的能力，形成免疫消除肿瘤，达到癌症免疫治疗的目标。 根据本专利技术的一方面，提供一种可作为免疫佐剂的融合蛋白，其为鞭毛蛋白 f lagelin的氨基酸序列A和热休克蛋白gp96的氨基酸序列B的融合蛋白。 在优选的实施方案中，本专利技术的融合蛋白中鞭毛蛋白flagelin来源于鼠伤寒沙 门氏菌菌株LT2。在另外优选的实施方案中，本专利技术的融合蛋白中热休克蛋白gp96来源于 人类。 优选地，本专利技术的融合蛋白的序列为SEQ ID NO :2所示的序列。 根据本专利技术的另一方面，提供一种核酸，其编码本专利技术所述的融合蛋白。优选地， 所述序列具有SEQ ID NO :1所示的序列。 根据本专利技术的其它方面，提供制备融合蛋白的方法，其中包括使本专利技术所述的核 酸在细胞表达系统或非细胞表达系统中进行翻译的过程。可选地，所述制备融合蛋白的方 法包括通过化学合成方式来合成肽的过程。 此外，本专利技术还提供本专利技术中所述的融合蛋白作为佐剂在制备用于治疗肿瘤的疫 苗中的用途。此外，本专利技术还提供本专利技术所述的核酸在制备用于治疗肿瘤的基团疫苗中的 用途。 根据本专利技术的其它方面，提供一种疫苗组合物，其包括本专利技术所述的融合蛋白和 肿瘤抗原。优选地，所述肿瘤抗原选自细胞抗原、病毒抗原和细菌抗原。 优选地，抗肿瘤疫苗组合物通过包括以下步骤的方法制备： (1)将肿瘤细胞经过2-10次反复冻融，释放出抗原，增加暴露抗原的数量，表位得 到增加，从而增强抗原的免疫原性； (2)引入白喉毒素，作为载体，有效地递送抗原到MHC类分子上； (3)加入T辅助表位mHSP70407-426,其来自结核杆菌，能诱导Thl的极化反应，同 时刺激Thl极化因子的表位； (4)将所述多种抗原、白喉毒素和T辅助表位mHSP70407-426用戊二醛偶联； (5)引入所述抗肿瘤疫苗佐剂。 其中，肿瘤细胞优选地选自由 HCC1599 ATCC CRL-2331、HCC1937 ATCC CRL-2336、 HCC1143 ATCC CRL-2321 和 MDA-MB-468 ATCC HTB-132 组成的组的至少之一。 本专利技术的融合蛋白不仅能够增强抗原递呈，还能够刺激特化免疫细胞，如树突状 细胞、CD8 +T淋巴细胞和自然杀伤（NK)细胞等功能性激活所必需的其他免疫信号。从而制 服癌症抑制机体天然免疫反应的能力本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗肿瘤疫苗佐剂，其为鞭毛蛋白flagelin的氨基酸序列A和热休克蛋白gp96的氨基酸序列B的融合蛋白Flagp96，其中所述抗肿瘤疫苗佐剂具有如下性质：(1)与Toll‑like受体结合，活化抗原提呈细胞，(2)启动特异性CD8+和CD4+T细胞免疫应答，和(3)具有分子伴侣功能，能与细胞内的多肽非共价结合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王亚军，伊焕发，田利明，吴瑜瑜，杜静，
申请(专利权)人：一达国际生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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